Tách ARN: Sử dụng các kỹ thuật mới cho việc tách chiết RNA
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (333.87 KB, 14 trang ) Tách ARN (RNA isolation) là một trong những quy trình phức tạp, mỗi người sẽ có Ảnh điện di: Sử dụng DNase loại bỏ ADN tổng số khỏi mẫu ARN (Nguồn ảnh: https://mobio.com/dnasetm-max-kit-1076.html) Vấn đề 2: ARN phân hủy/ ARN không nguyên vẹn Nhận biết: Các băng rARN xuất hiện các vệt smear trên bản gel hoặc băng 18S đậm hơn nhiều so với băng 28S. Ảnh điện di: ARN bị phân hủy và ARN nguyên vẹn (M. Marker, 1. ARN bị phân hủy và 2. ARN nguyên vẹn lên băng 18S và 28S) (Nguồn ảnh: https://www.thermofisher.com) Nguyên nhân: Sự phân hủy ARN diễn ra ở một vài thời điểm trong suốt quy trình nên rất khó để xác định chính xác hiện tượng này xảy ra trong giai đoạn thu mẫu (collection), bảo quản (storage), tách chiết (extraction) hay phân tách (isolation). Giải pháp: Nếu vấn đề này xuất hiện trong quá trình bảo quản, hãy đảm bảo mẫu sau khi thu ngay lập tức được giữ trong nitơ lỏng hoặc ở -80 oC; đối với mẫu là mô động vật, sử dụng RNALater và giữ ở -20oC. Nếu vấn đề xuất hiện trong quá trình tách chiết, hãy thêm beta-mercaptoethanol (BME) vào đệm ly giải (lysis buffer). Sử dụng 10 ul BME 14.3 M/ 1ml đệm. BME sẽ bất hoạt RNases và giúp giữ ổn định mẫu trong suốt quá trình tách chiết. Nếu mẫu được lấy ra từ tủ đông và không nằm trong dung dịch bảo quản, không được rã đông. Nhanh chóng làm đồng nhất mẫu trong BME. Chú ý ly giải mẫu hoàn toàn. Sự phân hủy bởi RNase có thể xảy ra sau khi phân tách do vậy cần đảm bảo rằng nước sử dụng cho quá trình rửa giải (elution) và tái hòa tan (resuspension) không nhiễm RNase. Vấn đề 3: Chất ức chế ARN Nhận biết: Tỷ số 260/230 thấp (dưới 1.0) hoặc tỷ số 260/280 thấp. Nguyên nhân: Tỷ số 260/230 thấp cho thấy hỗn hợp chứa muối guanidine hoặc các chất ức chế hữu cơ như acid humic, polysaccharides. Các muối guanidine bất hoạt RNase nhưng cũng ức chế các protein như enzyme RT. Tỷ lệ 260/280 thấp chứng tỏ ARN nhiễm protein. Giải pháp: Trường hợp tỷ số 260/230 thấp, cách tốt nhất là rửa mẫu thêm nhiều lần. Nếu TRIzol kết tủa, hãy rửa với ethanol để khử muối. Trường hợp sử dụng cột silica, rửa thêm vài lần bằng ethanol 70-80% để loại bỏ muối. Với các mẫu được tinh sạch chưa hoàn toàn, hãy dùng ethanol. Đối với các chất ức chế khác như acid humic và polysaccharides, cần tinh sạch lại mẫu trong một cột khác và rửa sạch trước khi rửa giải. Một vài hợp chất sẽ không được loại bỏ khỏi ARN (hoặc ADN) bằng phương pháp thông thường vì chúng tương tự acid nucleic. Như vậy, nên cân nhắc sử dụng các kỹ thuật loại bỏ chất ức chế cho mẫu tự nhiên. Tỷ số 260/280 thấp chủ yếu là do sử dụng lượng mẫu đầu vào lớn khiến protein không được loại bỏ hoàn toàn. Hãy làm sạch mẫu bằng phương pháp của bạn hoặc sử dụng phenol:chloroform hoặc thêm các muối gắn, ethanol để gắn với một màng lọc silica khác. Protein sẽ dễ dàng được loại bỏ. Lần thí nghiệm sau, cần chú ý sử dụng lượng mẫu ít hơn. Vấn đề 4: Lượng ARN thu được thấp Lượng ARN thu được có sự khác biệt rõ ràng giữa các kiểu tế bào, các loại mô khác nhau. Đối với ARN máu, hiệu suất thu được khác biệt tùy người. Nguyên nhân: Nếu lượng ARN thu được thấp hơn dự đoán và ARN vẫn nguyên vẹn thì sự phân hủy ARN không phải là nguyên nhân của hiện tượng này. Khi đó, quá trình nghiền đồng thể có thể là chưa hoàn toàn. Để phân tách ARN, bước ly giải đóng vai trò quan trọng. Các mẫu mô được lưu giữ trong RNALater thường khó làm đồng nhất hơn. Sai sót trong tính toán khối lượng mô hoặc số lượng tế bào có thể lý do khiến lượng ARN thu được thấp. Trong trường hợp này, số lượng tế bào thực tế có thể ít hơn tính toán. Giải pháp: Trường hợp ARN nguyên vẹn: chú ý vào phương pháp nghiền đồng thể, đảm bảo ADN tổng số bị phân cắt toàn bộ và ARN giải phóng hoàn toàn từ các tế bào vì bất cứ mảnh mô nào còn sót lại đều mang ARN. Sử dụng công cụ tính toán thật chính xác để định lượng chuẩn các mảnh mô hay đếm đúng số lượng tế bào. Nếu ARN bị phân hủy dẫn đến lượng thu được thấp, vấn đề có thể nảy sinh trong giai đoạn bảo quản hoặc nghiền đồng thể quá mạnh hay gia nhiệt quá lâu (nên tiến hành theo chu kỳ: gia nhiệt 30-45s -dừng 30s). Chú ý cắt các mẫu mô và nhanh chóng đưa chúng vào đệm ly giải guanidine lạnh (hoặc TRIzol) để ngăn chặn hoạt động của RNase. Với màng lọc xoay silica, cần đảm bảo quá trình rửa giải ở cột đủ để giải phóng ARN ra khỏi màng. Sử dụng thể tích nước lớn hơn trong quá trình rửa giải sẽ cho lượng ARN nhiều hơn. Kết luận Sự phân tách ARN từ các nguồn khác nhau đều tuân theo một quy trình tương tự. Trong đó, quá trình nghiền đồng thể là bước đầu tiên và quan trọng nhất. Quá trình này được thực hiện tốt sẽ giúp các tế bào nhanh chóng bị phá vỡ, RNases bị bất hoạt trong đệm ly giải và ADN tổng số phân hủy tới kích thước dễ dàng được rửa trôi. Rna extraction 1. RNA EXTRACTIONRNA extraction is the purification of RNA from biological samples. 2. Là sự Tinh sạch arn từ mẫu sinh học. 3. 2. DNA --------------> mRNA --------------> protein Lots of information in mRNA: When is gene expressed? What is timing of gene expression? What is the level of gene expression? (but what does an mRNA measurement really say about expression of the protein?) 4. Nhiều thông tin trong mrna : biểu hiện gen ở đâu? Khi nào biểu hiện gen? mức dộ biểu hiện gen? Nhưng những đo lường của rna nói về những biểu hiện gì của prootein? 5. 3. RNA in a typical eukaryotic cell:10-5 micrograms RNA80-85% is ribosomal RNA1520% is small RNA (tRNA, small nuclear RNAs)About 1-5% is mRNA -- variable in size -but usually containing 3 polyadenylation 6. Rna trong mẫu nhân chuẩn điển hình 7. 8. 4. The problem(s) with RNA:RNA is chemically unstable -- spontaneous cleavage ofphosphodiester backbone via intramoleculartransesterificationRNA is susceptible to nearly ubiquitous RNA-degradingenzymes (RNases) RNases are released upon cell lysis RNases are present on the skin RNases are very difficult to inactivate -- disulfide bridges conferring stability -- no requirement for divalent cations foractivity 9. 5. Common sources of RNase and how to avoid theContaminated solutions/buffers USE GOOD STERILE TECHNIQUE TREAT SOLUTIONS WITH DEPC (when possible) MAKE SMALL BATCHES OF SOLUTIONSContaminated equipment USE RNA-ONLY PIPETS, GLASSWARE, GEL RIGS BAKE GLASSWARE, 300 °C, 4 hours USE RNasefree PIPET TIPS TREAT EQUIPMENT WITH DEPC 10. 6. INHIBITORS OF RNASE DEPC: diethylpyrocarbonate Alkylating agent, modifying proteins and nucleic acids Fill glassware with 0.1% DEPC, let stand overnight at room temp. or NaOH or H2O2 Solutions may be treated with DEPC (0.1%), then autoclave (DEPC breaks down to CO2 and ethanol) Vanadyl ribonucleoside complexes Competitive inhibitors of RNAses, but need to be removed from the final preparation of RNA Protein inhibitors of RNAse horseshoe-shaped, leucine rich protein, found in cytoplasm of most mammalian tissues must be replenished following phenol extraction steps 11. 7. Making and using mRNA (1) 12. 8. Making and using mRNA (2) 13. 9. BASIC STEPS IN ISOLATINGRNA FROM CLINICAL SPECIMENS Separate WBCs from RBCs, if necessary Lyse WBCs or other nucleated cells in presence of protein denaturants, RNase inhibitors Denature/digest proteins Separate proteins, DNA, and contaminants from RNA Precipitate RNA if necessary Resuspend RNA in final buffer 14. 10. SELECTIVE CAPTURE OF MRNA Oligo dT is linked to cellulose matrix RNA is washed through matrix at high salt concentration Non-polyadenylated RNAs are washed through polyA RNA is removed under low-salt conditions (not all of the non-polyadenylated RNA gets removed Poly(U) sepharose chromatography Poly(U)coated paper filters Streptavidin beads: A biotinylated oligo dT is added to guanidinium- treated cells, and it anneals to the polyA tail of mRNAs Biotin/streptavidin interactions permit isolation of the mRNA/oligo dT complexes 15. 11. RNA ISOLATION METHODSCESIUM CHLORIDE GRADIENT Used mainly to get clean RNA for Northern blots Homogenize cells in guanidinium isothiocyanate and bmercaptoethanol solution. Add to CsCl gradient and centrifuge for 1220 hours; RNA will be at the bottom of tube. Re-dissolve in TE/SDS buffer. Precipitate RNA with salt and ethanol, then rehydrate. Advantage: high quality Disadvantages: extremely timeconsuming, hazardous materials disposal issues 16. 12. RNA ISOLATION METHODSGUANIDINIUM-BASED ORGANIC ISOLATIONGUANIDINIUM THIOCYANATE-PHENOL-CHLOROFORM EXTRACTION IS THEMOST COMMON METHOD. (TRIZOL METHOD). liquid-liquid Phenol/guanidinium (chaotropic ) solution disrupts cells, extraction solubilizes cell components, but maintains integrity of technique RNA. Add chloroform, mix, and centrifuge. Proteins/DNA remain at interface. RNA is removed with aqueous top layer. RNA is precipitated with alcohol and rehydrated. Advantage: faster than CsCl method better purity no RNA is lost Disadvantages: fume hood required, hazardous (Phenol and chloroform) waste disposal issues, chaotropic 17. 13. RNA ISOLATION METHODS NONORGANIC SALT PRECIPITATION Cellmembranes are lysed and proteins are denatured by detergent (such as SDS) in the presence of EDTA or other RNase inhibitors. Proteins/DNA are precipitated with a high concentration salt solution. RNA is precipitated with alcohol and rehydrated. Advantages: 18. Fast and easy, nontoxic 19. Produces high quality RNA 20. 14. RNA ISOLATION METHODSAFFINITY PURIFICATION OF RNAθ Lyse cells, and spin to remove large particulates/cell debrisθ Apply lysate (containing nucleic acids and cellular contaminants) to column with glass membraneθ Wash with alcohol to remove contaminants; nucleic acids stick to glass membrane while contaminants wash through. Treat with DNase enzyme to remove contaminating DNA.θ Apply water to the column; purified RNA washes off the glass and is collectedθ Disadvantage θ cannot adsorb RNA transcripts shorter than 200 bp (siRNA and miRNA) 21. 15. NUCLEIC ACID ANALYSIS DNA or RNA is characterized using several different methods for assessing quantity, quality, and molecular size. 22. UV spectrophotometry 23. Agarose gel electrophoresis 24. Fluorometry 25. Colorimetric blotting 26. 16. QUANTITY định lượng FROM UV SPECTROPHOTOMETRY Quang phổ DNA and RNA absorb hấp thụ maximally at 260 nm. Proteins absorb at 280 nm. Background scatter gaiir nền phân tán absorbs at 320 nm. 27. 17. QUANTITY FROM UV SPECTROPHOTOMETRY [DNA] =(A260 A320) X dilution pha loãng factor X 50 µg/mL [RNA] =(A260 A320) X dilution factor X 40 µg/mL Concentration cô đặc = µg of DNA or RNA per mL of hydrating solution hòa tan 28. 18. QUANTITY FROM UV SPECTROPHOTOMETRY CALCULATING YIELD hiệu suất Multiply nhân the concentration of the DNA or RNA sample by the volume of hydrating solution added.Example for DNA: 150 µg/mL X 0.1 mL = 15 µg Concentration from Volume thể tích of DNA yield UV Spec. (µg DNA hydration per ml of hydrating solution solution) 29. 19. QUALITY FROM UVSPECTROPHOTOMETRY A260/A280 = measure of purity (A260 A320)/(A280 A320) 1.7 2.0 = good DNA or RNA <1.7 = too much protein or other contaminant (?) 30. 20. QUALITY FROM AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS Genomic DNA: 31. 0.6% to 1% gel, 0.125 µg/mL ethidium bromide in gel and/or in running buffer 32. Electrophorese at 7080 volts, 4590 minutes. Total RNA: 33. 1% to 2% gel, 0.125 µg/ml ethidium bromide in gel and/or in running buffer 34. Electrophorese at 80100 volts, 2040 minutes. 35. 21. RNA SIZE AND QUALITY FROM AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS Size: mRNA may be smaller or larger than ribosomal RNA (rRNA). Quality: High-quality RNA has these characteristics: 36. 28S rRNA band : 18S rRNA band = 2:1 intensity 37. Little to no genomic DNA (high MW band) Note: If 18S rRNA is more intense than 28S rRNA, or if both bands are smeared, RNA degradation is probable. Useradiolabelled poly dT in a pilot Northern hybridization--should get a smear from 0.6 to 5 kb on the blot 38. 22. CULTURED CELL RNA DNA 28S 18S 100 50 25 ng 5S rRNA, tRNA, Genomic DNA and other small Degraded RNA markers RNA molecules mRNA = background smear high low MW 39. 23. STORAGE CONDITIONS Store DNA in TE buffer at 4 ° C for weeks or at 20 ° C to 80 °C for long term. Store RNA in RNase-free ultra pure water at 70 °C. 40. 24. TROUBLESHOOTING NUCLEIC ACIDPREPARATION METHODS Purifying RNA: the key is speed Problem: No or low nucleic acid yield. 41. Make sure that ample time was allowed for resuspension or rehydration of sample 42. . Repeat isolation from any remaining original sample (adjust procedure for possible low cell number or poorly handled starting material). 43. Concentrate dilute nucleic acid using ethanol precipitation. 44. 25. TROUBLESHOOTING NUCLEIC ACIDPREPARATION METHODS Problem: Poor nucleic acid quality 45. If sample is degraded, repeat isolation from remaining original sample, if possible. 46. If sample is contaminated with proteins or other substances, clean it up by re-isolating (improvement depends on the extraction procedure used). B ướ c 4: L ưu tr ữ c ủa RNA Isolated Bước cuối cùng trong mỗi RNA giao thức cách ly, dù cho tổng ho ặc mRNA chu ẩn bị, là resuspend tủa RNA tinh khiết. Sau khi cẩn thận chuẩn bị một mẫu RNA, điều quan trọng là RNA bị đình ch ỉ và được lưu trữ trong một môi trường an toàn, RNase-mi ễn phí. Chúng tôi khuyên bạn nên lưu trữ RNA ở -80 ° C trong dung dòch đơn sử dụng, lơ lửng trong một trong m ột số các gi ải pháp l ưu tr ữ RNA được thiết kế cho mục đích này: THE giải pháp lưu trữ RNA (1 mM sodium citrate, pH 6,4 ± 0,2) 0.1 mM EDTA (trong nước siêu sạch DEPC được điều trị) TE Buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0) Giải pháp RNAsecure resuspension TE và 0,1 giải pháp mM EDTA thường được quy định trong s ự cô lập và phân tích các giao th ức RNA thông thường. Những giải pháp lưu trữ lý tưởng cho các nhà nghiên cứu đã sử dụng chúng, nh ưng muốn sự tiện lợi và an ninh của họ có cho premade và ch ứng nh ận RNase-mi ễn phí. Chúng tôi cũng đã giới thiệu THE Giải pháp lưu tr ữ RNA, m ột b ộ đệm mang lại s ự ổn định RNA l ớn hơn 0,1 mM EDTA hoặc TE. THE Giải pháp lưu trữ RNA có hai tính năng gi ảm thi ểu quá trình th ủy phân cơ sở của RNA: pH thấp, và sodium citrate, hoạt động cả hai nh ư là m ột b ộ đệm pH và m ột tác nhân tạo phức (cation hóa trị hai xúc tác thủy phân cơ sở của RNA). THE Giải pháp lưu trữ RNA tương thích với tất cả các ứng dụng RNA thông thường nh ư phiên mã ng ược, dịch trong ống nghi ệm, phân tích phía bắc, và các xét nghiệm bảo vệ nuclease. Các RNAsecure thuốc thử là một thuốc thử nonenzymatic duy nh ất cho s ự bất hoạt không h ồi phục của RNases trong các phản ứng enzym. Nó được cung cấp ở một nồng độ 25X và có thể được thêm vào các mẫu để làm bất hoạt RNases.RNAsecure resuspension Giải pháp ch ứa các thành phần hoạt tính tương tự như các RNAsecure Thuốc thử, nhưng được cung cấp ở một n ồng độ làm việc cho resuspension trực tiếp của viên RNA. Để làm bất hoạt RNases, viên RNA được lơ lửng trong dung dịch RNAsecure resuspension và đun nóng đến 60 ° C trong 10 phút. Một tính năng độc đáo của giải pháp RNAsecure là hâm nóng sau khi điều trị ban đầu s ẽ kích hoạt lại các đại lý RNase phá hủy để giảm thiểu bất kỳ chất gây ô nhiễm mới. Chúng tôi liên tục phát minh ra cách để làm cho phân tích RNA d ễ dàng hơn. Chúng tôi làm việc chặt chẽ với khách hàng và đồng nghiệp của chúng tôi để cung cấp sản phẩm độc đáo để giải quy ết những vấn đề các nhà nghiên cứu thường xuyên gặp phải khi làm vi ệc với các RNA. công nghệ Ambion® tảng RNAlater® Giải pháp, bộ dụng cụ RNA cô lập, và gi ải pháp l ưu tr ữ RNA. các giải pháp phân tích RNA Ambion® được thiết kế để làm việc cùng nhau để đưa bạn tất cả các cách t ừ b ộ s ưu tập mẫu để phân tích ứng dụng RNA của bạn. Nếu bạn có đề xuất cho các sản phẩm bổ sung mà sẽ hữu ích trong nghiên cứu RNA của bạn, xin vui lòng liên h ệ với chúng tôi. Hàng đầu B ướ c 3: đị nh l ượ ng RNA Isolated RNA định lượng là một bước quan trọng và cần thiết tr ước khi h ầu h ết các ph ương pháp phân tích RNA. Ở đây chúng ta thảo luận về ba phương pháp thường được s ử dụng để định lượng RNA và lời khuyên cho việc tối ưu hóa từng phương pháp. UV phổ Phương pháp truyền thống để đánh giá nồng độ RNA và độ tinh khiết là UV quang ph ổ. Độ hấp thụ của mẫu RNA pha loãng được đo tại 260 và 280 nm. Nồng độ axit nucleic được tính toán bằng cách sử dụng luật Beer-Lambert, dự đoán những thay đổi tuyến tính trong hấp thụ v ới n ồng độ (Hình 3). Hình 3. Beer-Lambert Luật cho tính hấp thụ tia cực tím của axit nucleic. Sử dụng phương trình này, một A 260 đọc là 1,0 tương đương với ~ 40 mg / mL sợi đơn RNA. A 260 / A tỷ lệ 280 được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết RNA. A 260 / A tỷ lệ 280 1,8-2,1 chỉ RNA tinh khiết. UV quang phổ là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để định lượng RNA. Nó là đơn giản để thực hiện, và quang phổ tia cực tím có sẵn trong hầu hết các phòng thí nghi ệm .Phương pháp này không có một số nhược điểm, nhưng chúng có thể được giảm thiểu bằng cách làm theo nh ững l ời khuyên này: Phương pháp này không phân biệt đối xử giữa RNA và DNA, và nó được khuyến khích đầu tiên điều trị mẫu RNA với DNase RNase-miễn phí để loại bỏ ô nhiễm DNA. chất gây ô nhiễm khác như protein còn lại và phenol có thể can thiệp vào bài đọc h ấp th ụ, vì vậy cần phải cẩn thận trong quá trình thanh l ọc RNA để loại b ỏ chúng. đọc mẫu được thực hiện trong cuvette thạch anh. cuvette bẩn và các hạt bụi gây ra tán xạ ánh sáng tại 320 nm, có thể ảnh hưởng đến hấp thụ ở 260 nm. Kể từ khi không phải protein cũng không axit nucleic hấp thụ ở 320 nm, thực hiện điều chỉnh nền bằng cách đọc t ừ m ột khoảng trống (pha loãng chỉ) ở 320 nm, cũng như 260 nm và 280 nm. A 260 / A tỷ lệ 280 là phụ thuộc vào cả độ pH và sức mạnh ion. Khi pH tăng, A 280 giảm trong khi A 260 là không bị ảnh hưởng. Điều này dẫn đến tăng A 260 / A tỷ lệ 280 [1]. Bởi vì nước thường có độ pH axit, nó có thể làm giảm A 260 / A tỷ lệ 280. Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng một giải pháp đệm có độ pH kiềm nhẹ, chẳng hạn như TE (pH 8,0), như một chất pha loãng (và nh ư m ột tr ống) để bảo đảm đọc chính xác và tái sản xuất. Một ví dụ về sự thay đổi trong A 260 / A tỷ lệ 280tại các giá trị pH khác nhau được thể hiện trong hình 4. Hãy chắc chắn rằng pha loãng RNA của bạn nằm trong khoảng tuy ến tính c ủa quang ph ổ k ế của bạn. Thông thường ghi hấp thụ nên rơi giữa 0.1 và 1.0. Các giải pháp cho bài đọc ngoài phạm vi này không thể đo lường một cách chính xác. Nói chung là lỗi lớn nhất xảy ra ở nồng độ thấp. Hình 4. Ảnh hưởng của pH trên A 260 / A tỷ lệ 280. Thu ốc nhu ộ m hu ỳnh quang Một số thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn nh ư các Quant-iT RiboGreen® RNA thuốc thử , triển lãm một nâng cao huỳnh quang lớn khi bị ràng bu ộc với các acid nucleic. Ít nhất là 1 ng / mL RNA có thể được phát hiện và định lượng bằng thuốc thử RiboGreen® với một fluorometer tiêu chuẩn, đầu đọc huỳnh quang microplate, hoặc lọc fluorometer. Để định lượng chính xác RNA, chưa biết được âm mưu chống lại một đường cong chuẩn được sản xuất với một mẫu có nồng độ nhất, thường dựa trên độ hấp thụ của nó ở 260 nm. Các tuyến tính từ định lượng với RiboGreen® thuốc thử có thể kéo dài ba đơn đặt hàng của các cường độ (1 ng / mL đến 1 mg / mL) khi hai n ồng độ thuốc nhuộm khác nhau được sử dụng. Hơn nữa, xét nghiệm Quant-iT RiboGreen® RNA thuốc thử là tương đối không nhạy cảm với các chất ô nhiễm axit nucleic phi th ường được tìm thấy trong các chế phẩm axit nucleic, do tuyến tính được duy trì. Phương pháp định lượng RNA có thể được tối ưu hóa sử dụng các mẹo sau đây: Ngoài RNA, Quant-iT RiboGreen® RNA Thuốc thử có thể liên k ết v ới DNA và phát ra huỳnh quang. Đó là khuyến khích để điều trị các mẫu RNA với DNase RNase-miễn phí để loại b ỏ ô nhiễm DNA trước khi định lượng. Các Quant-iT RiboGreen® RNA Thuốc thử có thể hấp th ụ các mặt c ủa ống. Điều này có thể được giảm thiểu bằng cách chuẩn bị các giải pháp trong không dính nuclease mi ễn polypropylene Plasticware. Bảo vệ RiboGreen® RNA Thuốc thử từ suy thoái quang bằng cách gói container v ới lá, và s ử dụng các thuốc thử trong vòng vài tiếng để chuẩn bị. Tránh lặp lại chu kỳ đóng băng-tan của tiêu chuẩn RNA. Điều này có thể gây ra các sợi-sự cắt của RNA, dẫn đến giảm nhuộm ràng buộc. Ngoài ra, các axit nucleic có thể hấp thụ các ống với chu kỳ đóng băng-tan lặp đi lặp lại. Hiện tượng này trở nên rõ rệt hơn ở nồng độ thấp. Agilent® 2100 Bioanalyzer Instrument Các Agilent® 2100 Bioanalyzer cụ sử dụng một s ự kết hợp của microfluidics, đi ện di mao qu ản, và thuốc nhuộm huỳnh quang gắn với acid nucleic để đánh giá cả nồng độ RNA và toàn v ẹn. Sau khi mồi Bioanalyzer Lab Chip với ma trận tách, thang RNA và các mẫu được n ạp trong các gi ếng được chỉ định trên chip. Kích thước và khối lượng thông tin được cung cấp bởi huỳnh quang của các phân tử RNA khi chúng di chuyển thông qua các kênh của chip. Các phần mềm công cụ tự động so sánh khu vực đỉnh cao từ các mẫu RNA không biết đến vùng k ết hợp sáu Agilent® RNA đỉnh 6000 Thang RNA để xác định nồng độ của các mẫu chưa biết. Các Agilent® RNA 6000 Nano Hệ thống có một phạm vi hoạt động rộng và có thể định lượng 25-500 ng / ml RNA, trong khi Agilent® RNA 6000 Pico Chip hệ thống có thể xác định số lượng 50-5,000 pg / ml RNA. Có lẽ tính năng mạnh mẽ nhất của Agilent® 2100 Bioanalyzer c ụ có khả năng cung c ấp thông tin về tính toàn vẹn RNA. Vì mỗi mẫu RNA được phân tích, phần mềm tạo ra cả một hình ảnh giống nh ư gel và một electropherogram. Khi phân tích RNA, một thuật toán phân tích được sử d ụng để đánh giá tính toàn vẹn của các mẫu RNA (RNA Liêm Số, hoặc RIN) với m ột giá trị t ối đa 10 gi ảm đáng k ể trong RIN là biểu hiện của RNA bị suy thoái. 8. 4. Các vấn đề (s) với RNA: RNA là chất hóa học không ổn định - phân chia tự phát ofphosphodiester xương sống qua intramoleculartransesterificationRNA là dễ gần khắp nơi RNA-degradingenzymes (RNases) RNases được phát hành theo RNases tế bào ly giải được hiện diện trên RNases da rất khó khăn để làm bất hoạt - cầu disulfide trao ổn định - không có yêu cầu cho các cation hóa trị hai foractivity 9. 5. Nguồn gặp của RNase và làm thế nào để tránh các giải pháp theContaminated / bộ đệm SỬ DỤNG TỐT vô trùng KỸ THUẬT TREAT GIẢI PHÁP VỚI DEPC (khi có thể) ĐẶT lô nhỏ của SOLUTIONSContaminated SỬ DỤNG thiết bị "RNA-ONLY" PIPETS, THỦY TINH, GEL RIG BAKE THỦY TINH, 300 ° C, 4 giờ SỬ DỤNG "RNase-free" TIPS Pipet XỬ THIẾT BỊ VỚI DEPC 10. 6. ỨC CHẾ HÀNH RNASE DEPC: diethylpyrocarbonate alkyl hóa đại lý, sửa đổi protein và axit nucleic Điền thủy tinh với 0,1% DEPC, để yên qua đêm ở nhiệt độ phòng. hoặc NaOH hoặc H2O2 Giải pháp có thể được điều trị bằng DEPC (0,1%), sau đó hấp (DEPC phá vỡ thành CO2 và ethanol) Vanadyl ribonucleoside phức chất ức chế cạnh tranh của các RNases, nhưng cần phải được loại bỏ từ khâu chuẩn bị cuối cùng của RNA Protein chất ức chế RNase hình móng ngựa, protein giàu leucine, được tìm thấy trong tế bào chất của hầu hết các mô động vật có vú phải được bổ sung theo các bước khai thác phenol 1. 7. Tạo và sử dụng mRNA (1) 12. 8. Tạo và sử dụng mRNA (2) 13. 9. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRÊN ISOLATINGRNA TỪ MẪU LÂM SÀNG bạch cầu riêng biệt từ hồng cầu, nếu cần thiết Lyse bạch cầu hoặc các tế bào có nhân khác trong sự hiện diện của chất làm biến tính protein, các chất ức chế RNase biến tính / tiêu hóa protein protein riêng biệt, DNA và các chất bẩn từ RNA tủa RNA nếu Resuspend cần thiết RNA trong bộ đệm cuối cùng 14. 10 CAPTURE CHỌN LỌC CÁC MRNA Oligo dT được liên kết với ma trận cellulose RNA được rửa qua ma trận ở nồng độ muối cao RNA không polyadenylated được rửa qua Polya RNA được lấy ra trong điều kiện ít muối (không phải tất cả các RNA không polyadenylated được removed Poly (U) Sepharose chromatography Poly (U) tráng kim loại giấy filters streptavidin hạt: Một oligo dT biotinylated được thêm vào các tế bào guanidinium được điều trị, và nó anneals đến đuôi Polya của mRNAs Biotin / tương tác streptavidin phép cô lập của / oligo dT hợp mRNA 15. 11. RNA cô lập METHODSCESIUM CHLORIDE GRADIENT Được sử dụng chủ yếu để có được RNA sạch cho Bắc blots đồng nhất tế bào trong isothiocyanate guanidinium và b-mercaptoethanol solution. Thêm vào CsCl gradient và máy ly tâm cho 12-20 giờ; RNA sẽ ở dưới cùng của tube. Re-tan trong TE / SDS buffer. tủa RNA với muối và ethanol, sau đó rehydrate. Ưu điểm: Nhược điểm quality cao:, vấn đề xử lý cực kỳ tốn thời gian vật liệu nguy hiểm 16. 12. RNA cô lập METHODSGUANIDINIUM DỰA ISOLATIONGUANIDINIUM HỮU thiocyanate-phenol-chloroform EXTRACTION LÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG themost. (TRIZOL PHƯƠNG PHÁP). lỏng liquid Phenol / guanidinium (chaotropic) giải pháp phá vỡ tế bào, solubilizes khai thác các thành phần tế bào, nhưng vẫn duy trì tính toàn vẹn của kỹ thuật RNA. Thêm chloroform, trộn, và centrifuge. Protein / DNA vẫn ở RNA interface. được lấy ra bằng dung dịch nước đầu layer. RNA được kết tủa với rượu và rehydrated. Ưu điểm: nhanh hơn so với phương pháp CsCl độ tinh khiết tốt hơn không có RNA là Nhược lost: fume hood yêu cầu, độc hại, các vấn đề (Phenol và chloroform) xử lý chất thải, chaotropic 17. 13. PHƯƠNG PHÁP RNA cô lập NONORGANIC SALT PRECIPITATION Cellmembranes được ly giải và protein bị biến tính bởi chất tẩy rửa (như SDS) trong sự hiện diện của EDTA hoặc RNase khác inhibitors. protein / ADN được kết tủa với RNA muối nồng độ cao solution. được kết tủa với rượu và rehydrated. Ưu điểm: 18. nhanh và dễ dàng, không độc hại 19. Tạo RNA chất lượng ciao RNA cô lập METHODSAFFINITY thanh lọc tế bào RNA Lyse, và quay để loại bỏ các hạt bụi lớn / cell debris Áp dụng lysate (có chứa axit nucleic và các chất ô nhiễm của tế bào) để cột với kính membrane Rửa với rượu để loại bỏ chất gây ô nhiễm; axit nucleic dính vào màng kính trong khi chất gây ô nhiễm rửa qua. Hãy đối xử với enzyme DNase để loại bỏ ô nhiễm DNA. Áp dụng nước để các cột; rửa RNA tinh khiết đi qua kính và là collected Bất lợi không thể hấp thụ phiên mã RNA ngắn hơn 200 bp (siRNA và miRNA) 21. 15. acid nucleic ANALYSIS DNA hoặc RNA được đặc trưng bằng các phương pháp khác nhau để đánh giá số lượng, chất lượng và kích thước phân tử. 22. UV Phổ 23. điện di gel agarose 24. Fluorometry 25. thấm đo màu 26. 16. SỐ LƯỢNG định luồng từ DNA và RNA UV Phổ Quang phổ hấp thụ hấp thụ tối đa ở 260 Protein nm. hấp thụ ở 280 nền nm. phân tán gaiir nền phân tán hấp thụ ở 320 nm. 27. 17. SỐ LƯỢNG TỪ UV SPECTROPHOTOMETRY [DNA] = (A260 - A320) tố X pha loãng pha loãng X 50 mg / mL [RNA] = (A260 - A320) X pha loãng tố X 40 mg / mL Nồng độ cô đặc = mg DNA hoặc RNA mỗi ml dung dịch dưỡng ẩm hòa tan 28. 18. SỐ LƯỢNG TỪ Phổ UV TÍNH NĂNG SUẤT performance Multiply nhân nồng độ của các mẫu DNA hoặc RNA bởi khối lượng ẩm giải pháp added.Example cho DNA: 150 mg / mL X 0,1 ml = 15 mg Nồng từ Khối lượng thể tích của sản lượng DNA UV Spec. (Hydrat hóa DNA mg mỗi ml dung dịch dung dịch dưỡng ẩm) 29. 19. CHẤT LƯỢNG TỪ UVSPECTROPHOTOMETRY A260 / A280 = số đo độ tinh khiết (A260 - A320) / (A280 - A320) 1.7 - (?) 2.0 = DNA hoặc RNA tốt <1,7 = quá nhiều protein hoặc chất gây ô nhiễm khác 30. 20. CHẤT LƯỢNG TỪ DNA agarose GEL ELECTROPHORESIS gen: 31. 0,6% đến 1% gel, 0,125 mg / mL ethidium bromide trong gel và / hoặc chạy bộ đệm 32. Electrophorese tại 70-80 volt, 45-90 minutes. RNA tổng số: 33. 1% đến 2% gel, 0,125 mg / ml ethidium bromide trong gel và / hoặc chạy bộ đệm 34. Electrophorese tại 80-100 V, 20-40 phút. 35. 21. RNA SIZE VÀ CHẤT LƯỢNG TỪ agarose GEL ELECTROPHORESIS Kích thước: mRNA có thể nhỏ hơn hoặc lớn hơn RNA ribosome (rRNA) . Chất lượng: Chất lượng cao RNA có các đặc điểm: 36. 28S rRNA ban nhạc: 18S rRNA ban nhạc = 2: 1 cường độ 37. Ít hoặc không có DNA (ban nhạc MW cao) Lưu ý: Nếu 18S rRNA là mãnh liệt hơn 28S rRNA, hoặc nếu cả hai ban nhạc được bôi, suy thoái RNA là probable. Useradiolabelled nhiều dT trong một phi công Bắc lai - nên có được một smear 0,6-5 kb trên blot 38. 22. CELL CẤY RNA DNA 28S 18S 100 50 25 ng 5S rRNA, tRNA, bộ gen DNA và RNA dấu suy thoái nhỏ khác RNA phân tử mRNA = background smear cao MW thấp 39. 23. Bảo quản CONDITIONS hàng DNA trong đệm TE ở 4 ° C trong tuần hoặc ở -20 ° C đến -80 ° C cho term. dài hàng RNA trong nước siêu tinh khiết RNase-miễn phí tại -70 ° C. 40. 24. TROUBLESHOOTING nucleic ACIDPREPARATION METHODS Purifying RNA: chính là vấn đề speed: Không có hoặc sản lượng axit nucleic thấp. 41. Hãy chắc chắn rằng có đủ thời gian được phép cho resuspension hoặc bù nước của mẫu 42.. Lặp lại sự cô lập từ bất kỳ mẫu gốc còn lại (điều chỉnh hình thức cho số di động thấp nhất có thể hoặc kém xử lý nguyên liệu ban đầu). 43. Tập trung pha loãng axit nucleic sử dụng kết tủa ethanol. 44. 25. TROUBLESHOOTING nucleic METHODS Vấn đề ACIDPREPARATION: Chất lượng axit nucleic nghèo 45. Nếu mẫu là suy thoái, lặp lại sự cô lập từ còn lại mẫu ban đầu, nếu có thể. 46. Nếu mẫu bị ô nhiễm với các protein hoặc các chất khác, làm sạch nó lên bằng cách tái cô lập (cải tiến phụ thuộc vào các thủ tục khai thác sử dụng). |
