Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện như thế nào?
Bao gồm 6 bước:
1. Hai loại ADN được ly trích: ADN có chứa gen cần tạo dòng và
plasmid của vi khuẩn đóng vai trò của một vector.
2. Cả ADN và plasmid được xử lý với cùng một loại enzyme giới hạn.
Enzyme giới hạn tạo ra đầu dính ở plasmid và ADN cần tạo dòng.
3. Đoạn ADN cần tạo dòng được trộn với plasmid.
4. Nhờ enzyme ligase, các base ở đầu dính của plasmid sẽ gắn với
các base bổ sung ở đầu dính của ADN tạo thành plasmid tái tổ hợp.
5. Plasmid tái tổ hợp được chèn vào tế bào vi khuẩn.
6. Sự tạo dòng gen. Vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp sẽ sinh sản.
Khi vi khuẩn tạo thành một dòng tế bào, tất cả các gen của plasmid tái tổ
hợp cũng được tạo dòng.
Hình 1: tr49
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
NỘI DUNG:
Các enzyme giới hạn
Phương pháp điện di
Các vector chuyển gen
Sự tạo ADN tái tổ hợp
Chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Các enzyme giới hạn: (retriction enzyme)
Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận
biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt
ADN ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận.
Có 2 đặc tính:
- Không cắt các liên kết photphodieste
ở đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phân
tử ADN.
- Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc
thù (trình tự nhận biết) bao gồm 4 đến 8 nucleotide
( thường là 4 hay 6).
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1. Hiện tượng giới hạn:
Các phage xâm nhiễm tế bào vi khuẩn
và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi
khuẩn. Khi số lượng phage tăng lên hàng triệu bản
sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên,
trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn vẫn
nguyên vẹn và phage cũng không sinh sôi. Nguyên
nhân là do ADN của phage bị một hệ thống bảo vệ
của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập. Đây
chính là hiện tượng giới hạn.
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
2. Tên gọi:
Nguyên tắc:
- Chữ thứ nhất viết hoa là chữ đầu tên của giống vi khuẩn từ
đó enzyme giới hạn được ly trích.
- Chữ thứ hai và thứ ba không viết hoa, ứng với tên loài của vi
khuẩn nói trên.
- Chữ thứ tư viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng (nếu có).
- Chữ số La mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện
( trong trường hợp nhiều enzyme giới hạn cùng được tìm thấy ở một
loài vi khuẩn).
Ví dụ tr50: enzyme EcoRI
E = giống Escherichia
co = loài coli
R = chủng RYI3
I = enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
3. Phân loại:
Có 3 nhóm chính:
- Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển
trên ADN đến cách đó khoảng 1000 -5000nucleotide.
- Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.
- Loại III: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ADN ở vị trí cách đó
khoảng 20 nucleotide.
Enzyme giới hạn loại II được sử dụng chủ yếu vì nó cắt tại vị trí giới
hạn. Thường cắt ở trình tự chiều xuôi ngược như nhau. VD: EcoRI
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Bảng 1: Nguồn, trình tự nhận biết và vị trí cắt của một số enzyme giới hạn. (tr51)
ENZYME
NGUỒN
TRÌNH TỰ NHẬN BIẾT VÀ VỊ TRÍ CẮT
Alu I
Athrobacter lutues
5 ------- A G C T ------ 3
3 ------- T C G A ------ 5
Bal I
Brevibaterium
5 ------- T G G C C A ------ 3
3 ------- A C C G G T ------ 5
Bam H I
Bacillus amyloliquefaciens
5 ------- G G A T C C ------ 3
3 ------- C C T A G G ------ 5
Eco RI
Escherichia coli
5 ------- G A A T T C ------ 3
3 ------- C T T A A G ------ 5
Hae III
Haemophylus aegypticus
5 ------- G G C C ------ 3
3 ------- C C G G ------ 5
Hind III
Haemophylus influenzae
5 ------- A A G C T T ------ 3
3 ------- T T C G A A ------ 5
Sau 3A
Staphylococcus aureus
5 ------- G A T C ------ 3
3 ------- C T A G------ 5
Taq I
Thermus aquaticus
5 ------- T C G A ------ 3
3 ------- A G C T ------ 5
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Phương pháp điện di: (electrophoresis)
Phương pháp điện di là quá trình phân tách một hỗn
hợp các phân tử ADN nhờ một chất nền cố định (gel) trong
một điện trường.
Điện di ADN:
- Ở độ pH gần trung tính, ADN tích điện âm nên khi
chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về điện
dương của điện trường.
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Điện di ADN
- Bản gel hoạt động như một giá thể phân tách các đoạn
ADN.
- Các lỗ được tạo ra trong bản gel được xem như các
giếng chứa dung dich ADN.
- Hai loại gel thường được sử dụng trong nghiên cứu
ADN là gel polyacrylamide và gel agarose
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Điện di ADN
- Dung dịch ADN chứa hỗn
hợp các đoạn ADN có
kích thước khác nhau
được đổ vào các giếng
trong bản gel.
- Chất nền gel hoạt động
như một tấm sàng
(sieve). Các phân tử AND
lớn đi qua các lỗ trong
bản gel khó khăn hơn và
sẽ bị chậm lại so với các
phân tử AND nhỏ.
LỚP 2NT1 TỔ 1
CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
| 
