So sánh uv-vis và hplc

Ethanolic leaf extract of moringa oleifera a potential agent for treatment of hemorrhoids and its evaluation in croton o

• 3704 26850 1 PB - hay
• Drug Development Research - 2016 - Sugimoto - Topical Anti‐Inflammatory and Analgesic Effects of Multiple Applications of S
• 9789264242678-en - hay
• MIỆT THỊ NGOẠI HÌNH - ebubvxjbxcn n

Related documents

• 200 huyet thuong dung-S
• BỘ CÂU HỎI THI ĐIỀU DƯỠNG GIỎI
• Ôn tập mô tế bào - thực vật chương mô tb
• Bản sao của Se hoá dược - aaaaaaaaaaaaaaaaaaa
• 8. DCCT Module TIM MACH ctu53+k54 (3case)
• đề tài liệt VII ngoại biên moi

Preview text

CÂU 6: CẤU TẠO, NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA HPLC:

Cấu tạo cơ bản của hệ thống HPLC:

• Hệ thống cung cấp pha động ( dung môi pha động).
• Bơm.
• Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hoặc tự động).
• Cột và pha tĩnh.
• Detector.
• Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu.
• HỆ THỐNG CUNG CẤP PHA ĐỘNG:  Bình chứa dung môi:
• Bình chứa dung môi là bình thủy tinh không màu, trung tính, có thể tích từ 100 – 2000 ml, kín ( tránh bay hơi dung môi).  Dung môi pha động:
• Yêu cầu của dung môi pha động:
• Tinh khiết + Trơ về mặt hóa học + Giá thành thấp
• Tương thích với detector + Hòa tan mẫu phân tích
• Dung môi bơm vào phải không được chứa các bụi bẩn hoặc những vật lạ, bởi vì điều này có thể làm ảnh hưởng đến tuổi thọ của bơm và làm kẹt cột tách.  Vì vậy, cần phải lọc dung môi qua màng lọc 0,45 hoặc 0,22 m. Các loại màng lọc như:
• Nước: màng lọc cellulose nitrat, cellulose acetat.
• Dung môi hữu cơ: màng lọc teflon.
• Hỗn hợp DMHC và nước: màng lọc RC, polyamid hay nylon.
• Cần phải loại bỏ hoặc đuổi khí hòa tan hay các bọt khí trong dung môi vì khí hòa tan có thể làm biến dạng pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền. Ta có thể loại khí ngay trong bình chứa dung môi ( siêu âm, sục khí trơ) hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi vào bơm.
• Siêu âm: đuổi khí thừa khỏi dung môi.
• Sục khí trơ ( helium): đuổi khí hòa tan khỏi dung môi.
• Khử ngay trên dòng ( online membrane degassing).
• pH của dung môi pha động:
• Trong phân tích dược, nhiều trường hợp cần điều chỉnh pH pha động bằng đệm pH.
• Thường sử dụng: đệm phosphat, perchlorate, sulfat,..ột số acid mạnh như: TCA ( trichloroacetate acid), TFA ( trifloroacetate acid).
• Ảnh hưởng đến độ phân tách và độ chọn lọc của peak.  Phương pháp rửa giải:
• Có 2 cách rửa giải:
• Đẳng dòng: Không thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải.
• Gradient: Tỷ lệ thành phần pha động thay đổi trong quá trình rửa giải.
• Ưu điểm của rửa giải gradient:
• Rút ngắn thời gian phân tích.
• Giảm hiện tượng kéo đuôi, cải thiện hình dạng pic.
• Tăng độ nhạy phân tích.
• HỆ THỐNG BƠM:  Chức năng:
• Chức năng của bơm là vận chuyển pha động đi qua cột tách với một tốc độ xác định.  Bơm cần đáp ứng một số yêu cầu khá cao về tính năng như sau:
• Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên.
• Bền với dung môi pha động.
• Tốc độ dòng có một khoảng rộng để chọn lựa và dễ thay đổi tốc độ dòng.
• Chiều dài: 10 – 25 cm.
• Đường kính trong: 4 – 10 mm.
• Cỡ hạt pha tĩnh: 3 – 10 mcm.
• Số đĩa lý thuyết: N = 40,000 – 60,000 đĩa/m. Gần đây, người ta có loại Cột nhỏ - microcolumn: chiều dài 3 – 7,5 cm, đường kính trong 1
• 2 mm, cỡ hạt 1,5 – 5 mcm, N = 100,000 đĩa/m. Ưu điểm nổi bật của chúng là tiết kiệm dung môi và rút ngắn thời gian sắc ký.  Chất nhồi cột sắc ký:
• Silica ( sillic dioxide) kết tụ thành silicagel.
• Silicagel được bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặt.
• Ngoài ra còn có các chất nhồi khác: Nhôm oxyd, hạt polyme xốp, hạt nhựa trao đổi ion.  Bộ phận điều nhiệt:
• Có chức năng ổn định nhiệt độ của cột.
• Độ chính xác ± 0,1độ C.
• Cho kết quả phân tách tốt hơn ( trong một số trường hợp).  Bảo vệ cột/ tiền cột:
• Cột bảo vệ được đặt sau bộ phận tiêm mẫu và trước cột tách để giúp bảo vệ những cột đắt tiền khỏi sự xâm nhập của các hạt bẩn nhỏ.
• Cột bảo vệ không làm thay đổi hiệu quả tách của cột.
• Được thiết kế với một thể tích tổng cộng tương đối nhỏ và thể tích chết nhỏ, nhờ vậy không làm doãng pic.
• Cột bảo vệ được nhổi đầy các hạt nhồi tráng phim mỏng hoặc có pha liên kết như trong cột phân tích.  Hạt pha tĩnh trong pha liên kết:
• Pha tĩnh được chế tạo từ silica ( silic dioxyde). Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản ứng với dẫn chất clorosilane tạo ra dẫn chất siloxan. Liên kết siloxan bền ở pH 2-7.
• Gốc R trong dẫn xuất siloxan quyết định tính phân cực của pha tĩnh và loại hình sắc ký là pha đảo hay pha thuận:  Sắc ký pha đảo:
• Pha tĩnh không phân cực: R = C8, C18, phenyl
• Pha động tương đối phân cực: Nước, MeOH, MeCN.
• Sắc ký pha đảo được sử dụng rộng rãi vì cho kết quả phân tách tốt với nhiều đối tượng ( 75% khối lượng sắc ký).
• Trong sắc ký pha đảo, chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu tăng lên.  Sắc ký pha thuận:
• Pha tĩnh phân cực: R = cyano, amino, diol.
• Pha động ít phân cực: Ethyl ether, cloroform, n-hexan.
• Trong sắc ký pha thuận, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần.
• DETECTOR:  Chức năng:
• Chức năng của detector là phát hiện pha động đi ra từ cột phân tích. Tín hiệu ra của detector là tín hiệu điện tỉ lệ thuận với một vài tính chất của pha động hoặc của chất tan trong mẫu.  Những đặc trưng quan trọng của detector trong HPLC:
• Nhạy
• Tuyến tính
• Đáp ứng chọn lọc hoặc thông dụng
• Đáp ứng không bị tác động bởi những thay đổi của các điều kiện
• Thể tích chết thấp
• Không dễ bị phá hủy
• Rẻ tiền, đáng tin cậy, dễ sử dụng. 5 Detector UV – VIS: Đây là detector được dùng phổ biến nhất trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV
• VIS ( trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích. Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ đường kính 1mm, chiều dài 1cm. a. Nguyên tắc:
• Cung cấp phổ UV – VIS của chất phân tích trong bước sóng đã chọn.
• Kiểm tra tính tinh khiết của sản phẩm và định danh sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước.
• Phát hiện đồng thời được chất phân tích ở nhiều bước sóng khác nhau, giúp cho việc xác định được bước song hấp thụ cực đại của một chất, cũng như phát hiện các tạp chất và các chất gây nhiễu ở bước sóng thấp hơn, không đặc trưng.
• Cung cấp sắc ký đồ 3 chiều giúp cho việc chọn điều kiện thích hợp để định lượng cũng như định danh các mẫu phân tích.
• Thích hợp cho việc định lượng đồng thời nhiều thành phần.
• Nhược điểm:
• Độ nhạy kém hơn detector UV – VIS đo ở bước sóng thay đổi. 5 Detector huỳnh quang:
• Ưu điểm:
• Chọn lọc hơn và nhạy hơn detector UV.
• Đáp ứng với các chất phát huỳnh quang.
• Có thể tạo dẫn chất phát huỳnh quang với những chất không phát huỳnh quang ( trước hoặc sau cột)
• Tương thích với rửa giải gradient.
• Nhược điểm:
• Không phát hiện được chất không phát huỳnh quang.
• Bị ảnh hưởng lớn của môi trường: dung môi, pH, nhiệt độ, độ nhớt, lực ion, khí hòa tan. 5 Detector chỉ số khúc xạ ( RID):
• Nguyên tắc: Hoạt động của detector theo nguyên lí đo vi sai. Tín hiệu đo là sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và của pha động hòa tan chất phân tích.
• Ưu nhược điểm:
• Đây là detector vạn năng đáp ứng với hầu hết các chất phân tích nhưng độ nhạy kém hơn detector hấp thụ UV có thể đến 1000 lần.
• Detector khúc xạ rất nhạy với nhiệt độ và khó sử dụng cho rửa giải gradient vì khó so sánh trị số khúc xạ của mẫu và pha động khi thành phần pha động thay đổi.
• Detector kém nhạy, có khoảng tuyến tính hẹp nên phạm vi sử dụng bị hạn chế.

5 Detector tán xạ bay hơi ( ELSD):

• Nguyên tắc: Dịch rửa giải từ cột sắc ký đi vào đầu detector được trộn với khí nito ở trong bộ phận phun sương. Hỗn hợp đi qua một kim nhỏ được phân tán thành đám sương mù kích thước đều nhau. Ở đây dung môi được bay hơi khỏi hạt sương, hạt rắn mịn được tạo thành. Các hạt rắn này đi cắt ngang chùm laser. Chùm tia laser bị tán xạ bởi các hạt rắn được phát hiện nhờ ống nhân quang.
• Có khả năng phân tích định tính thành phần của hỗn hợp.
• Xác định được nồng độ của mẫu.
• Có khả năng giữ lại các dữ kiện trong bộ nhớ để có thể lặp lại việc tính toán kết quả mà không cần đưa mẫu thử qua hệ thống sắc ký nhiều lần.
• Hiện nay các hệ thống SK được kết nối với hệ thống máy tính, các máy tính được cài đặt các phần mềm tiện dụng trong việc tính toán các phép tính từ đơn giản đến phức tạo một cách nhanh chóng, chính xác.

CÂU 7: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC:

1. Nguyên tắc chung: Dựa trên sự so sánh chiều cao hoặc diện tích pic trong mẫu thử với một hay nhiều mẫu chuẩn.
2. Pic hẹp và đối xứng: đo chiều cao hoặc diện tích pic.
3. Pic tù hay lệch phương: đo diện tích pic.
4. Phương pháp định lượng:
5. Định lượng so sánh với chuẩn Chuẩn ngoại 1 điểm ( so sánh trực tiếp) Chuẩn ngoại nhiều điểm ( đường chuẩn) Chuẩn nội Thêm chuẩn
6. Định lượng không có chuẩn Chuẩn hóa diện tích pic ( quy về 100% diện tích pic)

2 Định lượng so sánh với chuẩn. 2.1 Phương pháp chuẩn ngoại: a. Chuẩn ngoại 1 điểm ( so sánh trực tiếp):

• Phân tích bằng chiều cao pic:
• Phân tích bằng diện tích pic:

và càng gần nhau, kết quả càng chính xác. b. Chuẩn ngoại nhiều điểm ( đường chuẩn):

• Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau.
• Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn.
• Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao hay diện tích pic theo nồng độ.
• Tiến hành sắc ký mẫu thử. Dựa vào phương trình hồi quy suy ra nồng độ mẫu thử. 2.2 Phương pháp chuẩn nội:  Trường hợp áp dụng:
• Kết quả phân tích không lặp lại khi áp dụng phương pháp ngoại chuẩn ( xử lý mẫu phức tạp, thể tích tiêm mẫu không lặp lại, nồng độ chất phân tích nhỏ khoảng 1ppm).  Nguyên tắc:
• Thêm một chất chuẩn khác với chất cần định lượng ( chất chuẩn nội) vào mẫu thử và mẫu chuẩn.
• Tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số được sử dụng để xây dựng đường chuẩn.  Yêu cầu của chất chuẩn nội:
• Chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích.
• Có cấu trúc hóa học tương tự chất phân tích.
• Có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất phân tích.
• Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
• Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.  Độ nhạy phát hiện của chất chuẩn nội và chất phân tích thường khác nhau.  Xác định yếu tố hiệu chính Fs của chất chuẩn nội và chất phân tích:
• Ứng dụng rất hạn chế khi định lượng đa thành phần.
• Có thể áp dụng để định lượng gần đúng các hợp chất tự nhiên có độ tinh khiết cao.
• Pic dung môi và pic chính tương ứng với chất phân tích.
• Tỷ lệ % của diện tích pic cho biết hàm lượng tương đối của chất
• Nên sử dụng pha động làm dung môi pha mẫu thử.

CÂU 12. CẤU TẠO, NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA SẮC KÝ KHÍ:

Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký khí:

• Nguồn cung cấp khí mang: bình sinh khí hoặc máy sinh khí.
• Hệ thống điều khiển áp suất hoặc tốc độ dòng khí mang.
• Buồng tiêm mẫu: có nhiều loại khác nhau với mục đích phân tích khác nhau.
• Lò cột.
• Cột sắc ký.
• Detector
• Hệ thống ghi nhận và xử lý dữ liệu.
• NGUỒN CUNG CẤP KHÍ MANG:  Yêu cầu của khí mang  Các loại khí mang
• Trơ
• Phù hợp với detector
• Độ tinh khiết cao
• Dễ sử dụng
• Rẻ
• Không có nguy cơ phát cháy
• Cho hiệu quả cột tốt nhất

Hydrogen

• Tách mẫu tốt
• Dẫn nhiệt tốt
• Phản ứng với các hợp chất không no và dễ bắt lửa Helium
• Tách mẫu tốt, cho peak hẹp (chuyển khối nhanh hơn)
• Dẫn nhiệt tốt
• Giá thành đắt Nitrogen
• Độ nhạy giảm
  • Giá thành rẻ

2. HỆ THỐNG ĐIỀU KHIỂN ÁP SUẤT HOẶC TỐC ĐỘ DÒNG KHÍ MANG.

• Đảm bảo dòng khí mang ổn định về áp suất và tốc độ dòng.
• BỘ PHẬN TIÊM MẪU:
• Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vi lượng ( Microsyringe) để tiêm một mẫu lỏng hoặc mẫu khí qua một đệm cao su silicon ( septum) chịu nhiệt, vào một buồng hóa hơi ( injector). Buồng này được đốt nóng với nhiệt độ thích hợp và được nối với cột tách.
• Buồng hóa hơi trực tiếp:
• Kỹ thuật này áp dụng cho cột nhồi hay cột megabore. Tốc độ dòng đạt khoảng 10 ml/phút.
• Buồng tiêm là ống kim loại chèn bên trong ống thủy tinh. Ống kim loại được gia nhiệt đến nhiệt độ sôi của các cấu tử cần tách.
• Phần đầu của buồng tiêm là vách bằng cao su. Phần cuối nối với cột.
• Lượng mẫu tiêm nhỏ: đối với mẫu lỏng ( 0,1 – 10 l) và đối với mẫu khí ( 0,5 -5 ml).
• Nhiệt độ ở cổng tiêm mẫu thường được điều chỉnh cao hơn ít nhất 50⁰C so với điểm sôi cao nhất của thành phần trong mẫu.  Một số kỹ thuật tiêm mẫu:

1. Kỹ thuật tiêm mẫu chia dòng:

• Áp dụng: Thích hợp với mẫu có cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn 0,1% mẫu.
• Quá trình tiêm mẫu:
• Đánh giá: Tăng độ nhạy, giảm sự phân hủy mẫu do nhiệt. d. Kỹ thuật tiêm bay hơi nhanh:
• Áp dụng cho cột nhồi.
• Mẫu tiêm vào vùng có nhiệt độ cao hơn 20 – 50 độ C so với nhiệt độ cột.
• Mẫu bay hơi nhanh, có thể làm phân hủy mẫu. e. Kỹ thuật tiêm Autosamplers:
• Để có được độ tái lập tốt trong những lần tiêm, người ta sử dụng kĩ thuật tiêm autosamplers.
• Các syringer tự động trong quá trình hút, tiêm mẫu và rửa.
• CỘT VÀ LÒ CỘT: Sắc ký khí sử dụng 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản. Tùy theo loại mẫu, độ phức tạp của mẫu để chọn loại cột thích hợp. 4 Cột nhồi:  Đặc điểm:
• Thường dùng các máy thế hệ cũ hoặc các máy có mục đích sử dụng đặc biệt.
• Vật liệu cột thông thường là thủy tinh, thép không gỷ hoặc đồng.
• Chiều dài cột: 1- 3m
• Đường kính trong 2-3cm
• Trong cột được nhồi đầy các hạt rắn được bao bởi pha tĩnh lỏng trên bề mặt ( có bề dày 0,05 – 1mcm)
• Kích thước hạt nhồi: 150 – 250 mcm.  Nhận xét:
• Kích thước hạt càng lớn, hiệu lực cột càng giảm. Tuy nhiên, nếu kích thước hạt quá nhỏ thì càng ít không gian trống giữa các hạt và áp suất để ép pha động qua cột phải càng cao.
• Nếu cột quá dài thì cần phải có áp suất ở đầu cột lớn  cột không quá dài dẫn đến số đĩa lý thuyết thấp, hiệu lực cột giảm.
• Đường kính cột lớn nên ít chịu ảnh hưởng của tạp chất  mẫu không cần tinh chế kỹ.
• Hiện nay có một số cột nhồi có d < 1mm cho phép nâng chiều dài cột lên vài chục met.  Các cột nhồi có đường kính nhỏ thường được dùng trong:
• Các phép phân tích cần độ phân giải cao.
• Cơ chế hấp phụ đặc biệt.
• Phân tích với nhiệt độ rất cao.
• Tốc độ tăng – giảm nhiệt độ rất nhanh. 4 Cột mao quản:  Đặc điểm:
• Chiều dài cột: 10-100m, nằng silica nung chảy.
• Mặt trong được phủ bởi lớp pha tĩnh lỏng có bề dày 0,1 – 0,5 mcm.
• Có 2 loại cột mao quản:
• Cột có lớp bao ở mặt trong thành cột: WCOT ( wall coated tubular).
• Cột có lớp chất mang bao pha tĩnh: SCOT ( support coated tubular).

Cột WCOT được sử dụng phổ biến hơn vì:

• Hiệu lực cao hơn.
• Mặt ngoài cột có lớp bảo vệ polyamid dễ uốn, bền và trơ. Cột WCOT cải tiến hiện được dùng phổ biến có đường kính trong 0,22 mm và 0,32 mm và hai loại nhỏ hơn 0,15 mm và 0,20 mm ( có độ phân giải cao hơn). Ngoài ra, cột mao quản với đường kính trong lớn hơn: 0,53 mm thường được gọi là cột megabore, có thể tiêm lượng mẫu lớn hơn. 4 Lò cột:
• Chức năng: Bảo đảm tính lặp lại của thời gian lưu  Lò ổn nhiệt.
• Đối với mẫu đơn giảm: isothermal; đối với mẫu phức tạp, cần tách các cấu tử dựa vào nhiệt đột sôi: chương trình hóa nhiệt độ.
• Pha tĩnh không phân cực: dẫn chất dialkyl siloxan, hydrocarbon bão hòa.
• DETECTOR:  Chức năng:
• Phát hiện dựa trên sự thay đổi tính chất vật lý hoặc tính chất riêng biệt của chất phân tích khi rửa giải.  Phân loại:
• Detector vạn năng
• Detector chọn lọc  Yêu cầu:
• Đáp ứng nhanh và lặp lại với sự có mặt của chất phân tích.
• Giới hạn phát hiện cao
• Khoảng tuyến tính rộng
• Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng.  Một số loại detector phổ biến: 6 Detector dẫn nhiệt ( TCD):
• Là detector đa năng, không chọn lọc.

Tín hiệu đo dựa trên khả năng làm nguội điện trở ( đã được gia nhiệt) khác nhau giữa khí mang và chất phân tích.