 Loading Preview Sorry, preview is currently unavailable. You can download the paper by clicking the button above.
Sau khi học, học viên có khả năng: Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPN Trình bày được phạm vi áp dụng, nguyên tắc và các bước tiến hành định lượng E.coli giả định trong môi trường nước bằng phương pháp MPN. Bạn đang xem trước 20 trang nội dung tài liệu Định lượng E.coli giả định bằng phương pháp mpn, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNHBẰNG PHƯƠNG PHÁP MPNPhạm Thị Vinh HoaPhòng Xét nghiệm trung tâm- Indicators of microbial water quality: General (process) microbial indicatorsFaecal indicators (such as E. coli)Index organisms and model organisms.US Environmental Protection Agency The EPA has determined that E. coli are one of the best indicators for the presence of potentially pathogenic bacteria. Because E. coli monitoring does not measure the actual pathogens, the assessment is not foolproof, however, it is a good approach for assessing the likelihood of risks to human health. Monitoring for these indicator organisms is an easy and economical method for citizens or professionals to assess health risks due to bacterial contamination of surface waters. coli (E. coli): Thermophilic coliforms that produce indole from tryptophan, but also defined now as coliforms able to produce β-glucuronidase (although taxonomically up to 10% of environmental E. coli may not). Most appropriate group of coliforms to indicate faecal pollution from warm-blooded animals.ẠI SAO CẦN KIỂM TRA ESCHERICHIA COLI?ESCHERICHIA COLIình que, Gram-âm, không sinh bào tử Lên men đường lactose sinh hơi và acid ở 44oCSự có mặt của E.coli khẳng định sự nhiễm khuẩn từ phânTÀI LIỆU THAM KHẢOTCVN 5999:1995 (ISO 5667/10:1992): Chất lượng nước. Lấy mẫu. Hướng dẫn lấy mẫu nước thảiTCVN 8880:2011 (ISO 19458:2006): Chất lượng nước. Lấy mẫu để phân tích vi sinh vậtTCVN 6187-2:1996 (ISO 9308/2:1990): Chất lượng nước. Phát hiện và đếm vi khuẩn coliform, vi khuẩn coliform chịu nhiệt và escherichia coli giả định. Phần 2: Phương pháp nhiều ống (số có xác suất cao nhất)MỤC TIÊU HỌC TẬPSau khi học, học viên có khả năng:Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPNTrình bày được phạm vi áp dụng, nguyên tắc và các bước tiến hành định lượng E.coli giả định trong môi trường nước bằng phương pháp MPN.Nhận định được kết quảNỘI DUNG BÀI GIẢNG1. Phạm vi áp dụng & nguyên lý2. Phương pháp MPN3. Chuẩn bị thí nghiệm4. Các bước tiến hành5. Đọc kết quảPhạm vi áp dụng Đếm số lượng coliform, coliform chịu nhiệt, và E.coli giả định trong mọi loại nước, kể cả nước có vật chất lơ lửng.Nguyên lýE.coli: Định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí và tạo thành Indol từ tryptophan khi nuôi cấy trong canh thang tăng sinh chọn lọc ở 44oC bằng phương pháp tính số có xác suất lớn nhất (Most Probable number -MPN)PHẠM VI ÁP DỤNG & NGUYÊN LÝPHƯƠNG PHÁP MPNnồng độ 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 độ pha loãng 101 102 103 104 105 106 107 Nồng độ và độ pha loãng mẫuPHƯƠNG PHÁP MPNXác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫuMỗi độ pha loãng được lặp lại nhiều lần (3 lần)Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và âm tínhSố lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫuNguyên tắc:Hai hệ thống MPN: Hệ thống 9 ống Hệ thống 15 ốngPHƯƠNG PHÁP MPNĐặc điểm:VSV mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy: sinh hơi, đổi màu môi trường... Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớnPHƯƠNG PHÁP MPNHệ thống 9 ốngHệ thống 15 ống10 ml môi trườngPHƯƠNG PHÁP MPN1. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN2. Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếpCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN3. Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợpCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN4. Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của VSV cần kiểm địnhSự đổi màu của môi trườngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN5. Ghi nhận số ống dương tính ở từng độ pha loãngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN6. Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSVTra bảngMPN/100mlKết quả101102103Các bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPNThứ tự ưu tiên chọn từ 1 41. Chọn nồng độ thấp nhất có tất cả ống (+) chọn 2 nồng độ nhỏ hơn để tính. Ví dụ 1 nếu có nhiều hơn 1 trong 3 nồng độ được chọn này không có ống (+) chọn nồng độ lớn nhất không có ống (+) và 2 nồng độ lớn hơn để tính. Ví dụ 4, 52. Nếu các nồng độ nhỏ hơn nồng độ lớn nhất có tất cả các ống (+) chọn 3 nồng độ mẫu nhỏ nhất trong cả dãy. Ví dụ 23. Chọn 3 nồng độ thấp nhất trong cả dãy, trong đó có ít nhất 1 ống (+). Ví dụ 34. Chỉ nồng độ đầu tiền có ống (+) chọn thêm 2 nồng độ pha loãng tiếp theo để tính ngay cả khi 2 nồng độ này không có ống (+) nào. Ví dụ 6, 7MẫuSố ống (+)13 3 2 1 023 3 3 3 032 2 1 1 043 3 0 0 052 2 0 1 0 63 0 0 0 072 0 0 0 0____ tổ hợp được chọnLựa chọn các độ pha loãng để tính kết quảKết quả: Số VSV (MPN/ml) = kết quả tra bảng x (f/10) Trong đó: f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n)Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10)Ví dụ: PHƯƠNG PHÁP MPN103104105201Kết quả:14x103/10=1,4x103 (MPN/ml)Tra bảngPHƯƠNG PHÁP MPN6. Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSVTra bảngMPN/100mlKết quả70x101/10=7,0x101 (MPN/ml)101102103PHƯƠNG PHÁP MPNSố VSV = 7,0x101 MPN/mlHệ thống 15 ốngPHƯƠNG PHÁP MPN321Kết quả?102103104Hệ thống 9 ốngPeptone water FlaskPipette Dụng cụ, Môi trường phải được khử trùng Môi trường phải được kiểm chứngLTS brothCHUẨN BỊ THÍ NGHIỆMEC brothThuốc thử Indol (Kovacs)Chủng chuẩn+ Chứng âm: Salmonella typhimurium ATCC 14028+ Chứng dương: Escherichia coli ATCC 25922Bước 1: Chuẩn bị mẫu Lấy 100ml mẫu nước bề mặt vào bình tam giác nồng độ 10o CÁC BƯỚC TIẾN HÀNHBước 2: Pha loãng mẫu Hút 1ml mẫu + 9ml MT peptone trong ống nghiệm nồng độ 10-1. Pha loãng tiếp tục để được các nồng độ 10-2 và 10-3 Bước 3: Nuôi cấy trên môi trường tăng sinh/chọn lọc 1 Nồng độ đơn: Hút 1ml mẫu pha loãng + 10ml MT Tryptose Lauryl Sunfat trong ống nghiệm nuôi cấy ở 37±1oC/24-48h. Nồng độ kép: Hút 10ml mẫu pha loãng + 10ml MT Tryptose Lauryl Sunfat trong ống nghiệm nuôi cấy ở 37±1oC/24-48h. kết quả (+): sử dụng lactose sinh khíBước 4: Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2 Cấy chuyển từ MT LTS (+) sang MT EC broth nuôi cấy ở 44oC/48hCÁC BƯỚC TIẾN HÀNHBước 5: Thử sinh hóa khẳng định cho E.coli Cấy chuyển từ MT EC broth (+) sang MT trypton nuôi cấy ở 44oC/48h nhỏ 0.5ml dd Kovacs vào ống nuôi cấy kết quả (+): sử dụng lactose sinh khí kết quả (+): tạo vòng Indol màu đỏThử nghiệm khả năng sinh IndolMục đíchPhát hiện các VSV có khả năng sinh indol các VSV có hệ emzym tryptophanaseChủng VSVMT canh tryptonThuốc thử Kovac’sPứ dương tínhPứ âm tính44oC / 24hCÁC BƯỚC TIẾN HÀNHSơ đồ các bước định lượng E.coli giả địnhĐỌC KẾT QUẢ(+)(-)(-)(+)Coliforms/E.coli trong MT LTS ĐỌC KẾT QUẢE.coli trong MT ECE.coli sinh Indol(+)(-)Nhiệm vụ của nhóm1. Nhóm 1 đến 5: mẫu MT PD05 Nhóm 1: 10-1, 10-2, 10-3 Nhóm 2: 10-2, 10-3, 10-4 Nhóm 3: 10-3, 10-4, 10-5 Nhóm 4: 10-4, 10-5, 10-6 Nhóm 5: 10-5, 10-6, 10-72. Nhóm 6 đến 10: mẫu MT HSPH Nhóm 6: 10-1, 10-2, 10-3 Nhóm 7: 10-2, 10-3, 10-4 Nhóm 8: 10-3, 10-4, 10-5 Nhóm 9: 10-4, 10-5, 10-6 Nhóm 10: 10-5, 10-6, 10-73. Nhóm 11: mẫu chứng âm, dương Chứng âm: Salmonella Chứng dương: E.coli Các file đính kèm theo tài liệu này:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGwww.hsph.edu.vnĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. coli BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN www.hsph.edu.vnMỤC TIÊU• Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPN (Most Probable Number) • Trình bày được phạm vi áp dụng của thử nghiệm• Nêu và thực hiện được các bước của qui trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPNwww.hsph.edu.vnPHƯƠNG PHÁP MPN(Phương pháp số có xác suất cao nhất)www.hsph.edu.vnPhương pháp MPN• Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một thể tích mẫu• Được thực hiện dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu• Thông thường các độ pha loãng được chọn liên tiếp nhauwww.hsph.edu.vnPhương pháp MPN (tt)• Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại nhiều lần (3 lần hoặc 5 lần)• Kết quả thống kê tính trên số lần dương tính của mỗi độ pha• Định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong một thể tích mẫu lớnwww.hsph.edu.vnPhương pháp MPN (tt)www.hsph.edu.vnPhương pháp MPN (tt)B1: Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượngwww.hsph.edu.vnPhương pháp MPN (tt)B2: Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếpB3: Ủ mẫu đã cấy ở nhệt độ thích hợpwww.hsph.edu.vnPhương pháp MPN (tt)B4: Ghi nhận sự phát triển của vi sinh vật trong MTB5: ghi nhận số ống dương tính3www.hsph.edu.vnLựa chọn các độ pha loãngThứ tự ưu tiên chọn từ 1→41.Chọn nồng độ thấp nhất có tất cả ống (+) → chọn 2 nồng độ nhỏ hơn để tính, ví dụ1; nếu có nhiều hơn 1 trong 3 nồng độ được chọn này không có ống (+) → chọn nồng độ lớn nhất không có ống (+) và 2 nồng độ lớn hơn để tính, ví dụ 4, 52.Nếu các nồng độ nhỏ hơn nồng độ lớn nhất có tất cả các ống (+) → chọn 3 nồng độ mẫu nhỏ nhất trong cả dãy. Ví dụ 23.Chọn 3 nồng độ thấp nhất trong cả dãy, trong đó có ít nhất 1 ống (+). Ví dụ 34.Chỉ nồng độ đầu tiên có ống (+) chọn thêm 2 nồng độ pha loãng tiếp theo để tính ngay cả khi 2 nồng độ này không có ống (+) nào, ví dụ 6, 7www.hsph.edu.vnPhương pháp MPN (tt)B6: Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV3KẾT QUẢwww.hsph.edu.vnPhương pháp MPN (tt)Kết quả:• Số VSV (MPN/g) = kết quả tra bảng x (f/10)• f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n)www.hsph.edu.vnMPN calculator software www.hsph.edu.vnPHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS/E. coli GIẢ ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPNwww.hsph.edu.vnColiforms• Trực khuẩn gram âm • Không sinh bào tử• Hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, • Có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờwww.hsph.edu.vnColiforms (tt)• Gồm 4 giống:E. coliCitrobacterKlebsiellaEnterobacter• Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị vệ sinh, trong đó có vệ sinh ATTPwww.hsph.edu.vnColiforms (tt)• Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC• Coliform phân: Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ khoảng 24h ở 440C trong canh Trypton• E. coli là một Coliforms phânwww.hsph.edu.vnPhạm vi áp dụng• Thực phẩm, thức ăn chăn nuôi• Các mẫu môi trường khu vực sản xuất và xử lý thực phẩmwww.hsph.edu.vnNguyên lý của phương pháp• Coliforms: Định lượng vi sinh vật lên menlactose sinh khí khi nuôi cấy trong môitrường tăng sinh chọn lọc ở 30oC, 37oC vàphù hợp trong phép thử khẳng định.• E. coli: là nhóm coliforms phân, được xácđịnh dựa trên khả năng lên men lactosesinh khí và tạo thành Indol từ Tryptophankhi nuôi cấy trong canh thang tăng sinhchọn lọc ở 44oCwww.hsph.edu.vnTIẾN HÀNHwww.hsph.edu.vnChuẩn bị môi trường• Canh thang LTS• Canh thang Brilient green• Canh thang EC• Canh thang Trypyonwww.hsph.edu.vnDụng cụ thí nghiệm• Bình tam giác• Ống nghiệm• Pipet• Đầu côn• Que cấy• Đèn cồn• Găng tay, khẩu trangwww.hsph.edu.vnChủng chuẩn• Chứng âm: Salmonella typhimurium ATCC 14028• Chứng dương: Escherichia coli ATCC 25922Các chủng phải ở trạng thái hoạt hoáwww.hsph.edu.vnColiforms and E. coliBước 1: Đồng nhất mẫu• Cân 10 g/10ml mẫu• Đồng nhất mẫu trong 90 ml dd NMSLtrong bình tam giác → nồng độ 10-1www.hsph.edu.vnColiforms and E. coliBước 2: Pha loãng mẫu• Hút 1ml mẫu đã đồng nhất ở trên• Pha loãng mẫu trong 9ml dd NMSL trong ống nghiệm → nồng độ 10-2• Pha loãng tiếp tục để được các nồng độ 10-3và 10-4… |
