Chương 2Sinh tổng hợp proteinĐiều hòa sinh tổng hợp protein1. Mã di truyềnDo chỉ có bốn loại nucleotide khác nhau trong mRNA và có đến 20 loại amino acidtrong protein nên sự dịch <strong>mã</strong> không thể được thực hiện theo kiểu tương ứng mộtnucleotide-một amino acid được. Người ta đã giải <strong>mã</strong> toàn bộ các amino acid vào nhữngnăm đầu của thập kỷ 1960. Mỗi amino acid được <strong>mã</strong> hóa bởi ba nucleotide liên tiếp trênDNA (hoặc RNA tương ứng), bộ ba nucleotide này được gọi là một codon. Với 4 loạinucleotide khác nhau sẽ có 4 3 = 64 codon khác nhau được phân biệt bởi thành phần và trậttự của các nucleotide. Trong số này có 3 codon kết thúc là UAA, UAG và UGA có nhiệmvụ báo hiệu chấm dứt việc tổng hợp chuỗi polypeptide. Trong 61 <strong>mã</strong> còn lại có nhiềucodon cùng <strong>mã</strong> hóa cho một amino acid .- Các codon được đọc theo hướng 5'→3'. Vì vậy chuỗi <strong>mã</strong> hóa cho dipeptide NH 2 -Thr-Arg-COOH được viết là 5'-ACGCGA-3'. Các codon không chồng lên nhau và vùngdịch <strong>mã</strong> của mRNA không chứa các khoảng trống.2. Các ribosomeRibosome là bộ máy đại phân tử điều khiển sự tổng hợp protein. Nó được cấu tạo bởiít nhất là ba phân tử RNA và hơn 50 protein khác nhau, với trọng lượng phân tử là 2,5MDa (megadalton) đối với ribosome của prokaryote và 4,2 MDa đối với ribosome củaeukaryote.2.1. Thành phần cấu tạo của ribosomeMỗi ribosome bao gồm một tiểu đơn vị lớn và một tiểu đơn vị nhỏ. Tiểu đơn vị lớnchứa trung tâm peptidyl transferase chịu trách nhiệm cho việc hình thành các cầu nốipeptide. Tiểu đơn vị nhỏ chứa trung tâm giải <strong>mã</strong>, là nơi các tRNA đã được gắn amino acidđọc và giải <strong>mã</strong> các codon. Ngoài ra còn có trung tâm gắn các yếu tố ở tiểu đơn vị lớn.Theo quy ước, các tiểu đơn vị được đặt tên theo tốc độ lắng của chúng dưới lực lytâm. Đơn vị đo tốc độ lắng là Svedberg và được viết tắt là S. Ribosome của prokaryote làribosome 70S, trong đó tiểu đơn vị lớn là 50S và tiểu đơn vị nhỏ là 30S. Ribosome củaeukaryote là 80S, với tiểu đơn vị lớn là 60S và tiểu đơn vị nhỏ là 40S.Mỗi tiểu đơn vị đều được cấu tạo bởi các RNA ribosome (rRNA) và các proteinribosome. Đơn vị Svedberg lại được sử dụng để phân biệt các rRNA (Bảng 2.1).Bảng 2.1. Các thành phần cấu tạo của ribosome.Các thànhphần cấu tạorRNATiểu đơn vịlớn (50S)rRNA 5S(120 Nu)rRNA 23S(2900 Nu)ProkaryoteTiểu đơn vịnhỏ (30S)rRNA 16S(1540 Nu)Tiểu đơn vịlớn (60S)rRNA 5,8S(160 Nu)rRNA 5S(120 Nu)rRNA 28S(4700 Nu)EukaryoteTiểu đơn vịnhỏ (40S)rRNA 18S(1900 Nu)Protein 34 protein 21 protein 49 protein 33 protein35 Show
“Ngôn ngữ” của DNA là nucleotides trong khi “ngôn ngữ” của protein là amino acids. Vậy cần một phép ánh xạ nào đó để chuyển đổi từ các nucleotides sang các amino acids. Trong di truyền phân tử 7, ta biết rằng chuỗi nucleotide qui định trật tự liên kết các amino acids. Có tất cả 20 amino acids tham gia vào cấu thành proteins (trên tổng số hơn 50 loại được phát hiện). Có 4 loại nucleotides khác nhau, nếu với chuỗi 2 nucleotides thì có thể biễu diễn 4^2=16 amino acids. Vậy cần ít nhất là chuỗi 3 nucleotides để có thể biểu diễn 20 amino acids, lúc này, số trật tự tạo thành là 4^3=64. Và cứ bộ 3 nucleotides ghép lại để biểu diễn cho 1 amino acids thì được gọi là 1 codon – hay còn gọi là 1 DNA word. Điều này được khám phá bởi Marshall Nirenberg cùng với nhóm của Har Khorana hay họ đã bẻ khóa được mã di truyền.  Năm 1962, Heinrich Matthaei và Marshall bắt đầu thí nghiệm để kiểm tra giả thuyết về “triplet codon”. Họ dùng chiết xuất từ E.coli vì họ tin rằng chúng có đủ mọi thành phần để chuyển mRNA thành proteins. Họ dùng DNase để hủy mọi DNA trong đó, để không còn template tạo ra mRNA. Và họ đưa vào đó một mRNA nhân tạo chỉ chứa toàn Uracil (nhờ phương pháp của Marianne Grunberg-Manago và Severo Ochoa). Tiếp đó, các amino acids được đánh nhãn phóng xạ (radiolabeled amino acids) cũng được thêm vào. Hỗn hợp thu được đưa vào máy li tâm, để quá trình phản ứng tạo protein xảy ra. Kết quả thu được là chuỗi polypeptides gồm toàn phenylalanine (PHE). Có nghĩa là triple UUU mã hóa cho PHE. Họ làm thí nghiệm tương tự với các chuỗi mRNA nhân tạo khác chứa toàn hoặc Cystosine (thu được polypeptide proline (PRO)), hoặc Arguanine (thu được lysine (LYS)), hoặc Guanine (không thu được gì). Với phương pháp đó, họ cùng các nhà khoa học khác dùng các RNA nhân tạo khác với trật tự kết hợp của các nucleotides khác nhau. Cuối cùng đã có thể tổng hợp được bảng sau với 50 triple codons Còn một vài chỗ trống trong bảng trên là do không thể tạo được mRNA nhân tạo dài có trật tự liên kết các nucleotide theo ý muốn. Ví dụ: một triple với hai G và một C thì có 3 khả năng xảy ra: CGG, GGC, GCG. Nên việc tạo ra chuỗi dài cùng đồng nhất một loại triple là rất khó. Phil Leder đã giúp hoàn thành phần còn lại bằng cách dùng tRNA đã được hoạt hóa (activated tRNA) để giải quyết vấn đề đó. (activated tRNA là tRNA khi nó đã có mang theo amino acid) Trong phần trước, ta đã biết tRNA là phân tử đem amino acids đến ribosomes để giúp tổng hợp protein. Mỗi tRNA sẽ gắn với một loại amino acids, vì thế có tất cả 20 loại tRNA. Năm 1962, Robert Holley đã tìm ra cấu trúc của tRNA. Mặc dù tRNA là một dải đơn, nhưng các nucleotides trên đó có liên kết hydrogen bon để tạo thành một vùng dải kép ngắn (như hình vẽ), làm cho tRNA có hình dáng như lá của cây cỏ ba lá (cloverleaf). Holley cho thấy rằng mọi tRNA đều có cấu trúc dạng lá cây ba lá như nhau. Tại một vị trí trên một trong các lá, một chuỗi gồm 3 nucleotides sẽ tạo thành một anti-codon, nó có chức năng đóng cặp với một mRNA codon tương ứng. Có nghĩa là, với mỗi mRNA codon, sẽ có một tRNA tương ứng không trùng lặp gắn vào nó để dựa vào đó, tRNA có thể kết hợp với amino acid mà mRNA codon đó mã hóa. Dùng hệ thống “cell-free translation system”, Zamecnik và nhóm của ông cho thấy tRNA được hoạt hóa khi có một amino acid gắn vào thân của tRNA đó (tRNA’s stem). Quá trình này đòi hỏi năng lượng (từ ATP). Như vậy thay vì dùng một chuỗi mRNA nhân tạo dài, ông chỉ dùng với chuỗi gồm 3 hoặc 6 nucleotides. Và tiếp đến cứ cho tRNA đã hoạt hóa gắn kết với chuỗi mRNA ngắn này (như hình vẽ). Và Phil Leder đã đề xuất ra cách để tách tRNA đã hoạt hóa đang được gắn với triple codon đã biết ra để tìm hiểu amino acid gắn vào tRNA đó là loại gì (theo hình vẽ). Từ đó, cho phép ta xác định amino acid mà triple codon này mã hóa. Kết quả thu được là bảng đầy đủ các loại triple codons và amino acdis tương ứng mà nó mã hóa: Đồng thời, Leder còn tìm hiểu được một gene được bắt đầu và kết thúc bởi các triple codone terminals như sau:
Với một amino acid, có thể có nhiều triple codons khác nhau cùng mã hóa cho nó. Có nghĩa là, biết được chuỗi amino acids của một protein, thì không thể biết được chuỗi nucleotide của gene mã hóa cho protein đó. Ví dụ: về sự thay đổi chuỗi polypeptide tạo thành khi có một hay nhiều nucleotide bị mất đi khỏi chuỗi mRNA (frame shift) List of amino acids: ARG: arginine PRO: PHE: … Vào đầu thập niên 1970, Fred Sanger đã phát triển phương pháp xác định được trình tự chuỗi các nucleotide trong một gene, gọi là “chain termination method”. Phương pháp này được dùng phổ biến hơn phương pháp của Alan Maxxam và Walter Gilbert. Ta sẽ tìm hiểu phương pháp này trong phần tiếp sau. Di truyền phân tử 7 – DNA –> RNA –> protein (central dogma)Đây là hình ảnh cắt lát của tế bào. Nhìn tổng thể, đó là một bộ máy phức tạp với nhiều cơ quan có màng bao bọc. Các bộ máy này hoạt động đồng bộ với nhau để giúp cho tế bào hoàn thành chức năng sống. DNA chứa genes tồn tại trong nhân tế bào (nucleus). Tuy nhiên, quá trình tổng hợp ra protein được mã hoá bởi genes lại được diễn ra riêng biệt trong tế bào chất (cytoplasm) mà cụ thể là tại ribosome – nằm ngoài nhân. Vậy câu hỏi đặt ra là “làm cách nào gene, là một phần của DNA nằm, trong nhân tế bào có thể giúp cho quá trình tổng hợp protein nằm ngoài nhân?“. Để trả lời, Francis Crick đã đề xuất khái niệm “Central Dogma” -theo đó thông tin di truyền được truyền 1 chiều: nghĩa là từ phân tử DNA thông tin được mã hoá sang mRNA rồi phân tử mRNA được vận chuyển ra ngoài nhân, tại đó thông tin được giải mã để sản xuất ra protein tương ứng. mRNA đóng vai trò là một loại phân tử truyền tải (carrier molecule). Và ông cho rằng ứng cử viên cho chức năng truyền tải đó là RNA được tìm thấy ở khắp cytoplasm của tế bào – mà sau này Sydney Brenner, Francois Jacob, và Matthew Meselson xác định sự tồn tại của carrier molecule này và đặt tên là mRNA (messenger RNA). RNA là ribose nucleic acid được tìm thấy chủ yếu trong cytoplasm. RNA cũng có backbone là sugar-phosphate như phân tử DNA. Điểm khác biệt đầu tiên là RNA dùng đường ribose, còn DNA dùng đường deoxyribose (nhóm -OH tại C2′ được thay bởi -H). Điểm khác biệt thứ 2 là DNA có các base A, T, G, C còn RNA đi với các base A, U, G, C (Thymine thay bằng Uracil). Tương ứng, ta có qui luật bắt cặp cho RNA là A-U, G-C qua hydrobonds. “Old” Central DogmaNhư vậy, ‘central dogma’ theo quan điểm của Watson-Crick là thông tin truyền từ DNA–> RNA–> protein. Tới đây Crick nhận thấy một vấn đề là làm sao các amino acids tự do có thể liên kết với carrier RNA (mRNA)? Và ông đưa ra giả thuyết là tồn tại các phân tử làm vai trò cầu nối (adaptor molecule) tuy nhiên ông chưa có câu trả lời. Và thực tế là có tới 20 adaptors (sau này do Zamenik tìm ra đã khẳng định tính đúng đắn của giả thuyết của Crick, và nó được đặt tên là tRNA – transfer RNA) khác nhau, mỗi cái sẽ gắn với mỗi loại amino acid để đem chúng đến ribosome là nơi tổng hợp ra protein. Tóm gọn lại central dogma là như sau:
“New” Central DogmamiRNA cũng được tổng hợp như mRNA. Tuy nhiên, thay vì được dịch mã (translated) như mRNA để tổng hợp ra protein, miRNA lại tự uốn lại (fold) để tạo ra một cấu trúc lặp vòng. Lúc đó, miRNA có thể nhắm đến một một mRNA cụ thể và ngăn cản mRNA nó được dịch mã, hay có thể huỷ hoại (degrade) mRNA đó. Các nghiên cứu gần đây cho thấy vai trò cực kì quan trọng của miRNA trong quá trình phát triển của cơ thể vì nó giúp ngăn ngừa biểu hiện một số gene (gene expression) do những sai sót của quá trình gọi là “ PHỤ LỤC1:Bước 1: từ 1 chuỗi DNA template, RNA polymerase sẽ giúp tổng hợp ra mRNA chứa thông tin di truyền của DNA đó theo qui luật bổ sung | DNA : mRNA | A – U | T – A | G – C | C – G Như vậy, theo qui luật bổ sung (complementary rule), mRNA sẽ là bản sao thông tin di truyền của DNA, mọi thay đổi (mutation) của DNA (nếu có) sẽ được thể hiện trong mRNA. CHÚ Ý: tRNA không chứa thông tin di truyền, nên tRNA không có thay đổi. Bước 2: mRNA đi ra khỏi nucleus, đến ribosome, tại đó 2 subunits của ribosome sẽ ghép lại và gắn chặt mRNA lại để bắt đầu quá trình tổng hợp proteins. Chú ý là để tổng hợp ra một protein cần các amino acids tự do, các amino acids này sẽ được tRNA đem đến, trật tự liên kết các amino acids này được qui định bởi trật tự các nucleotides bên trong mRNA. rRNA là một thành phần bên trong ribosomes cũng đóng vai trò giúp tổng hợp protein nhưng chức năng cụ thể thì chưa biết rõ. PHỤ LỤC2:Xác định ra tRNA Paul Zamecnik là nhà khoa học nghiên cứu về tổng hợp protein (protein synthesis). Vào thập niên 1950, ông chưa biết về giả thuyết “Central Dogma” và adaptors của Crick. Ông đã tiến hành tổng hợp protein và tiếp cận theo quan điểm sinh hóa (dùng các hợp chất để tổng hợp ra protein). Bằng cách chiết xuất từ tế bào gan của chuột (đó là một dung dịch nước có chứa mọi thành phần từ việc nuôi cấy tế bào). Năm 1953, ông đã chứng minh có thể tổng hợp ra protein từ chiết xuất này trong môi trường ống nghiệm. Để chứng minh sự tồn tại của các polypeptides, ông cho thêm một loại amino acid có đánh nhãn phóng xạ (radiolabeled) – C14 leucine – vào trong dung dịch. Ông ủ dung dịch (incubate) ở nhiệt độ cơ thể rồi đem vào máy li tâm (centrifuge). Chuỗi (radiolabelled) polypeptide được tạo thành, có chứa các radiolabelled amino acids, nặng hơn và chìm xuống dưới. Còn các amino acids rời, sẽ vẫn nổi ở trên (supernatant). Mahlon Hoagland, một thành viên trong Lab của Zamecnik, còn phát hiện ra một loại RNA khác – aminoacyltRNA synthetases – trong phần dung dịch của tế bào – nó nhằm hoạt hóa, cung cấp năng lượng cho các amino acids trước khi các amino acids này có thể tham gia vào quá trình hình thành proteins. Sau đó, năm 1955, Zamenick, Mary Stephensen và Hoagland phát hiện rằng các amino acids sau khi được hoạt hóa sẽ phải gắn vơí một phân tử RNA có trọng lượng thấp (low molecular weight soluble RNA) rồi từ đó mới được đưa đến ribosomes để tổng hợp ra proteins. Jim Watson, khi ghé thăm lab, đã phát hiện RNA có thể hòa tan trong tế bào chất (soluble RNA) giống với giả thuyết về adaptor của Crick. Mỗi soluble RNA bắt cặp với một đối tác amino acid và đưa amino acid này đến ribosome để tổng hợp ra protein. Soluble RNA sau này được đổi tên lại là tRNA (transfer RNA) PHỤ LỤC3:Phát hiện ra mRNA (messenger RNA) Tới thời điểm này, ta biết cách thức các amino acids được thu thập để có thể liên kết tạo thành proteins. Nhưng trật tự liên kết của các amino acids đó như thế nào? Điều này đã được mã hóa trong gene. Và câu hỏi là genetic code từ DNA được truyền đến ribosome như thế nào?
Họ xác định có một loại RNA thứ 3 (hai RNA đã đề cập là rRNA và tRNA) – một sản phẩm trung gian không tồn tại lâu dài – mang genetic code từ DNA tới ribosome. Để kiểm chứng, họ sử dụng vi khuẩn bị nhiễm phage (phage-infected bacteria) được tạo thành bằng cách: (1) cho vi khuẩn phát triển trong môi trường có đồng vị nặng (heavy isotopes) của carbon và nitrogen (C13N15) để đánh nhãn phóng xạ mọi RNA và protein của vi khuẩn. (2) Sau đó, cho vi khuẩn vào với phage, sau đó chuyển ngay vi khuẩn bị nhiễm phage sang môi trường thiếu đồng vị nặng nhưng vẫn chứa phóng xa (radioactive) P32. Trước khi phân tách vi khuẩn, họ cho dừng sự phát triển của phage. Và rồi trích xuất RNA và ribosomes ra khỏi vi khuẩn. Đưa phần trích xuất vào máy li tâm có density gradient (mật độ thay đổi) sẽ giúp tách rời nhiều thành phần để giúp phân tích sự phân bố của các đồng vị nặng và nhẹ trong ribosomes, cùng với việc tích hợp của P32 vào trong phage RNA mới tạo ra. Và ông xác định tồn tại một loại RNA mới được hình thành, do có chứa P32, chính là nơi chứa thông tin di truyền. Và RNA này được gọi là mRNA (messenger RNA). *** Làm cách nào để mỗi tRNA nhận biết amino acid tương ứng với nó? PHỤ LỤC4:Phát hiện ra miRNA (micro RNA) miRNA (μRNA) là một non-coding RNA (vì nó không dùng để dịch mã thành protein) và đóng vai trò điều chỉnh gene expression. miRNA có chiều dài rất ngắn (21-23 nucleotides) và trước đây chỉ được xem là một “junk” RNA (nghĩa là không có vai trò gì cả). miRNA đầu tiên được tìm ra có tên là lin-4 do Victor Ambros và các đồng nghiệp Rosalind Lee và Rhonda Feinbaum tại Đại học Harvard trong khi đang nghiên cứu sự phát triển của giun (nematode) Caenorhabditis elegans có đột biến. Sự ra đời của miRNA cho thấy RNA không chỉ làm duy nhất công việc tạo ra protein. Mục đích chính của miRNA là giảm biểu hiện gien (down regulate gene expression). Có nhiều loại miRNA đóng vai trò này. Người ta dự đoán có khoảng 1000 miRNA trong con người, và khoảng 500 trong chúng đã được nhận diện. Thông tin về nó có thể truy cập ở:
Sự tìm thấy miRNA đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thuốc (drug development). TERM:
SUMMARY: Central Dogma (luận thuyết trung tâm) là quan điểm cho biết đường đi (pathway) của thông tin di truyền qua đó giúp ta hiểu được quá trình di truyền được diễn ra như thế nào. Việc ra đời và hoàn chỉnh luận thuyết trải qua một thời gian với sự khám phá ra các loại RNA khác nhau (mRNA, miRNA, tRNA, rRNA) tham gia vào quá trình điều tiết biểu hiện gien (gene expression) References:
BỔ SUNG:
Di truyền phân tử 5 – “discover the secret of life” DNA shapeTrong các phần trước, ta đã biết phân tử DNA là nơi lưu giữ thông tin di truyền (nghĩa là chứa genes). DNA là một polymer, được tạo bởi các monomer là các nucleotides. Có 4 loại nucleotides: A, T, G, C. Mỗi gene là một đoạn DNA tạo bởi chuỗi các nucleotides nhưng vì chúng quá nhỏ, chưa có một kính hiển vi nào cho phép quan sát cấu trúc thực của một phân tử DNA. Vì thế, không ai biết các đơn phân nucleotides này sẽ kết hợp với nhau như thế nào để có thể mang một lượng lớn thông tin di truyền cần thiết để tạo ra một cá thể sống. Đó được gọi là bí ẩn của cuộc sống (the secret of life). Hay nói một cách chính xác là cấu trúc của DNA vẫn là một ẩn số vào thời điểm đó (1940s-1950s). Vào thời điểm đó, các mô hình thực nghiệm hay lí thuyết được nhiều nhà khoa học đề ra về cấu trúc của DNA đều không chính xác. Như đã đề cập trong phần trước, dù Levene đã đúng khi cho rằng các nucleotide liên kết theo nguyên tắc đầu 5′ đến 3′ (đường-phosphate-đường-phosphate-…), nhưng quan điểm về lý thuyết “tetranucleotide block” của ông là một sai lầm. Và Chargaff đã chỉnh sửa khiếm khuyết đó với quan điểm số Adenine = số Thymine, số Guanine = số Cytosine (tỉ lệ A = T, G = C). Vào thời điểm đó, một nhà khoa học khác tên là Linus Pauling dùng một kĩ thuật mới gọi là tinh thể học tia X (X-ray crystallography) để khám phá cấu trúc protein. Hình ảnh thu được từ kĩ thuật này là các mẫu nhiễu xạ (diffraction pattern), và bằng các kĩ thuật tính toán phức tạp nhờ máy tính có thể giúp xây dựng lại cấu trúc 3D của phân tử ở dạng tinh thể. Kết quả thành công thu được cho thấy viễn cảnh có thể dùng kĩ thuật X-ray crystallography để xem xét cấu trúc của DNA. Tuy nhiên, không dựa vào thực nghiệm, Watson và Crick đưa ra những suy luận riêng của mình và xây dựng mô hình cấu trúc phân tử một cách trực quan dùng các que cùng các quả cầu nhỏ (stick-and-ball models) – mỗi quả cầu nhỏ đại diện cho một đơn phân. Cấu trúc protein có dạng xoắn như cái mở nút chai (corkscrew-shaped structure) – hay còn gọi là alpha-helix (xoắn alpha) Để kiểm chứng cho những suy luận của mình, Francis và Watson cùng dựa vào thông tin từ các mẫu nhiễu xạ để tìm lời giải cho cấu trúc của DNA. Và nhờ may mắn, họ đã có thể kiểm chứng được sự đúng đắn của mô hình đưa ra khi dựa vào hình ảnh các mẫu nhiễu xạ tia X sau khi chiếu vào phân tử DNA ở dạng muối (salt of DNA – thời đó chưa tạo được tinh thể DNA) nhờ vào kĩ thuật X-ray crystallography (Bức ảnh này gốc là do Rosalind Franklin chụp tại King’s College ở London, và Wilkins là người cung cấp cho Watson & Crick). Vào thời đó, có 2 bức ảnh về mẫu nhiễu xạ của 2 sợi DNA khác nhau, đều do Rosalind Franklin và Maurice Wilkins chụp, xem ở hình sau. Franklin thì tập trung vào bức ảnh đầu do nó có vẻ phức tạp hơn và bà nghĩ nó có nhiều thông tin hơn, trong khi Wilkins thì chọn bức ảnh sau do tính đối xứng đơn giản của nó và bức ảnh này đã được đưa cho Watson & Crick xem để rồi họ đã có thể xác định tính chính xác của mô hình họ đưa ra. Trong hình ảnh chụp X-ray crystallography, ta thấy một chữ X mờ (fuzzy ‘X’) ở giữa phân tử, đó là mẫu cho thấy cấu trúc xoắn ốc (helical structure). Vì số luợng nucleotides tuân theo tỉ lệ A = T, và G = C, Watson đã có thể đưa ra qui luật bắt cặp (base pairing), nghĩa là A luôn liên kết với T, G liên kết với C. Đồng thời ông còn phát hiện ra một điều quan trọng: chiều dài liên kết A-T bằng chính xác với chiều dài liên kết G-C. Nếu vậy, mỗi bậc thang trong chuỗi xoắn kép sẽ có chiều dài bằng nhau, và bộ khung đường-phosphate sẽ ổn định. Lập luận này càng được củng cố vì mẫu nhiễu xạ rất cân đối, chứng tỏ chiều xoắn ổn định, hay đường kính của ốc xoắn được giữ nguyên. Nói tóm lại, James Watson và Francis Crick đã thành công với khám phá cấu trúc 3 chiều của một phân tử DNA: đó là chuỗi xoắn kép có dạng hình thang (ladder) cuộn vào nhau theo cùng 1 trục với các bậc thang (rungs of the ladder) chính là liên kết giữa các cặp bazơ chứa nitrogen (base pairing: A-T, G-C) ở 2 chuỗi. Hai đường thân của thang là luân phiên liên kết giữa gốc phosphate và phân tử đưởng deoxyribose theo chiều 5′-3′. Hướng xoắn là hướng đi lên theo qui tắc bàn tay phải (right-hand double helix) nên còn gọi là B-DNA. Một số nhà khoa học quan điểm tồn tại Z-DNA (hay left-hand twisted DNA) nhưng nó rất hiếm và chỉ là “in vivo” (tồn tại trong phòng TN). Tuy nhiên, số lượng bài báo sai lầm khi đề cập đến Z-DNA cũng không phải là ít và Tom Schneider tại NIH đã sưu tầm chúng tại http://www.lecb.ncifcrf.gov/~toms/LeftHanded.DNA.html. Cấu trúc B-DNA James Watson và Francis Crick công bố kết quả trên Nature, chỉ nêu ra suy luận và không có bằng chứng thực nghiệm nào cả. Đồng thời, không có lời cảm ơn nào đối với Franklin và Wilkins ngoại trừ câu: “We have also been stimulated by a knowledge of the general nature of the unpublished results and ideas of Dr. M.H.F. Wilkins, Dr. R.E. Franklin, and their co-workers at King’s College London“. Frankiln chết do bệnh ung thư năm 1958, nên chỉ có 3 người nhận giải Nobel vào năm 1962 vì họ không trao cho người đã chết (posthumously). (cấu trúc triple-helix do Pauling đề xuất) Về phần nhà khoa học Pauling, sau khi khám phá ra cấu trúc của protein, Pauling cũng chú ý đến DNA, nhưng rất tiếc là cấu trúc ‘triple helix‘ của ông đưa ra không chính xác. ‘Triple helix’ nghĩa là 3 chuỗi xoắn xen kẽ vào nhau. Pauling cho gốc phosphate làm lõi (core) của mỗi chuỗi xoắn với các gốc nitrogen hướng ra ngoài, và 3 chuỗi xoắn sẽ cuộn vào nhau để làm thành phân tử DNA. Sai lầm của Pauling là quên rằng các nguyên tử Oxi trong gốc phosphate tích điện âm (), nên khi nằm ở giữa, và các gốc phosphate này chồng lên nhau, chúng sẽ đẩy nhau, không thể tạo ra một phân tử bền vững. Sau này, Watson đóng vai trò quản lí dự án Human Genome Project, nhằm giải mã toàn bộ bộ gene của con người chứa trong human DNA. TERM:
SUMMARY: Watson và Crick là 2 người đã phát hiện ra cấu trúc DNA. Cấu trúc phân tử DNA là chuỗi xoắn kép với chiều xoắn theo chiều tay phải, hay còn gọi là B-DNA. Z-DNA là thuật ngữ dùng để cấu trúc DNA xoắn theo chiều tay trái, nhưng thực tế không tồn tại, ngoại trừ trong môi trướng thí nghiệm. ĐỌC THÊM: X-ray crystallography LINK:
Di truyền phân tử 3 – DNA make up geneTrong phần 1, ta biết DNA và protein đều quan trọng trong nhân tế bào. Phần 2 cho ta biết gene đóng vai trò chính tạo ra protein. Vậy gene nằm ở đâu? Trong phần 1, Leuvene và nhiều nhà khoa học khác vẫn cho rằng protein chứa gene. Như vậy bài toán “the egg and the chicken” xảy ra, nghĩa là gene tạo ra protein và protein chứa gene. Vậy quan điểm “protein chứa gene” đúng hay sai? Phần này, ta muốn khẳng định rằng chính DNA mới chứa gene – một gene là một đoạn của DNA. Điều này chỉ được làm sáng tỏ vào thập niên 1940. Oswald Avery (tại Rockfeller Institute, thập niên 1940) cùng đồng nghiệp đã tiến hành thí nghiệm trên vi khuẩn Pneumococcus, loại gây ra bệnh viêm phổi (pneumonia). Pneumococcus phát triển trong cơ thể vật chủ (ví dụ: chuột), nhưng đồng thời cũng có thể phát triển trong môi trường cấy lỏng hoặc đặc. Từ năm 1928, Fred Griffith công bố 2 dòng khác nhau của Pneumococcus: S và R.
Do cả 2 dòng S và R đều có thể được tìm thấy trên một mẫu bệnh. Nên Griffith suy đoán là từ dòng này có thể chuyển sang dòng kia. Để trả lời nghi vấn, ông đã thử nghiệm và phát hiện ra rằng dòng vi khuẩn R vô hại này vẫn có thể gây bệnh khi nó gặp phải virus của dòng S đã chết (virulent strain of bacteria) – dĩ nhiền dòng S đã chết thì bản thân không còn khả năng gây bệnh nữa. Như vậy, virus của dòng S đã chết có thể đã cung cấp thành phần hóa học nào đó giúp cho quá trình chuyển đổi (transform) từ dòng vô hại sang có hại – gọi là dòng S được nuôi cấy (S strain cultured). Đồng thời, dòng S được nuôi cấy này khi đưa sang con chuột khác khỏe mạnh cũng gây bệnh, nghĩa là sự thay đổi này có tính ổn định và kế thừa (stable & inherited). Vậy có thể nào virus của dòng S chết đã cung cấp một gene nào đó cần thiết cho quá trình hóa học giúp chuyển virus từ dòng R vô hại sang có hại. Câu trả lời dành cho Oswald Avery. Avery cùng với Colin Macleod, Maclyn McCarty bắt đầu tìm hiểu câu trả lời cho nguyên lí này. Họ không làm trực tiếp trên chuột mà dùng môi trường ống nghiệm (test tube assay) và dùng chất tẩy (detergent) để phá vỡ (lyse) các tế bào của dòng S đã bị chết. Các mãnh vở tế bào (cellular debris) sẽ được lắng xuống và dễ dàng tách các mảnh vỡ (lysate) nằm ở trên ra (lysate chính là thành phần bên trong của một tế bào đã được dung giải: gồm có lớp vỏ bọc tế bào (coat), protein, phân tử DNA và RNA).
+ No coat, no protein, no RNA: –> vẫn tạo ra dòng S từ dòng R. Còn lại cuối cùng là DNA, họ hủy DNA bằng cách đưa vào enzyme tiêu hóa DNA (DNase enzyme) + No coat, no protein, no RNA, no DNA: –> kết quả thu được là dòng R. Như vậy nó mất khả năng tạo ra dòng S từ dòng R. Tiếp, họ thay S-strain DNA bằng R-strain DNA thì DNA của R không thể tạo ra dòng S từ R được do DNA của R thiếu gene cần thiết để tạo ra được lớp vỏ bọc bằng đường (sugar coat). Việc tạo ra lớp vỏ bọc này sẽ giúp dòng R (R strain) chuyển thành dòng S. Khi phân tách ra dung dịch có chứa DNA, Avery và cộng sự nhận thấy nó có tính chất sệt, dày, và quánh (viscous, thick & stringy). Sau khi hủy DNA, thì dung dịch không còn tính chất đó nữa. Kết quả thu được cũng tương tự khi họ lắc mạnh dung dịch DNA. Việc lắc mạnh này làm gãy cấu trúc của DNA thành các mảnh nhỏ. Và khi đưa kết quả này vào với dòng R, thì cũng không tạo ra dòng S, nghĩa là việc làm đứt gãy DNA cũng làm mất tác dụng của gene hay các đoạn DNA không đủ dài để chứa gene. Khi chia đôi phân tử DNA, thì một bên có khả năng tạo ra dòng S khi kết hợp với dòng R, còn nửa còn lại thì không. Như vậy, có thể kết luận rằng gene là một đoạn DNA (đủ dài). Năm 1944, kết quả được công bố “DNA của S đóng vai trò quan trọng và là nơi lưu giữ gene.” Qui trình nghiên cứu của Griffith.Griffith phát hiện là chuột bị nhiễm dòng S thì phát triển bệnh viêm phổi và chết vài ngày sau đó. Nguyên nhân là do dòng S có lớp vỏ bọc hình viên nhộng (capsule-like coat) tạo bởi các phân tử đường giúp nó ngăn hệ miễn dịch của vật chủ (host’s immune system) tiêu diệt vi khuẩn. Vì thế, dòng S là lây nhiễm (infectious). Griffith nhận thấy rằng cả hai dòng khác nhau đều có thể được nuôi cấy (culture) từ cùng 1 vật chủ. Vậy, có thể nào từ dòng này chuyển sang dòng kia? Ông đã làm thí nghiệm: – nung nóng dòng S để làm chết vi khuẩn, sau đó + nếu đưa vào cơ thể chuột dòng S đã bị chết, vi khuẩn bị nhiệt độ làm chết đã không còn khả năng gây bệnh nữa. + nếu đưa vào cơ thể chuột dòng S đã bị chết đồng thời với dòng R còn sống thì chuột lại bị nhiễm bệnh viêm phổi và chết. Và từ con chuột chết này, Griffith đã có thể lấy ra dòng S còn sống. Như vậy, từ dòng R có thể chuyển sang dòng S và câu hỏi đặt ra là: bằng cách nào? CONCLUSION: DNA là nơi lưu giữ thông tin di truyền, cụ thể là gene. Gene là một phần trong chuỗi phân tử DNA. Đồng thời, ta cũng biết thêm rằng vi khuẩn cũng có DNA. LINK:
Di truyền phân tử 1 – DNA & protein are key molecules in cell nucleusTrong phần di truyền cơ bản, ta đã nói về các thuật ngữ genes, chromosome … ở mức độ ý niệm. Trong phần di truyền phân tử, ta sẽ tìm hiểu cấu trúc hóa học thực và bản chất của các khái niệm đó. Friedrich Miescher là nhà vật lí Thụy Sĩ đã tìm hiểu về thành phần hóa học của tế bào. Năm 1869, ông đã bắt đầu tìm hiểu tế bào máu trắng (white blood cells). Tế bào máu trắng là thành phần chính tạo thành mủ (pus) ở các vết thương. Ông đã thu thập các mủ dính tại các băng dán y tế bằng cách ngâm vào dung dịch muối (salt solution). Sau đó, cho dung dịch kiềm yếu (weak alkaline solution) vào, các tế bào sẽ được dung giải (lyse) và các nhân tế bào (cell nuclei) sẽ kết tủa (precipitate) tách ra khỏi dung dịch. Từ nhân tế bào (nuclei), ông đã phân tách ra được một thành phần hóa học duy nhất, ông gọi là nuclein (nghĩa là nằm trong nhân). Và nuclein tồn tại ở trong mọi tế bào mà ông đã thử nghiệm. NOTE: Sau này, người ta mới biết rằng nuclein chính thực ra là chromosomes. Về mặt hóa học, nuclein có chứa rất nhiều phospho, và Miescher nghĩ rằng nuclein đóng vai trò là nơi lưu trữ các phân tử phospho (phosphorous atom) cho tế bào. Lúc đó, Miescher vẫn chưa nghĩ hay tìm ra được chức năng sinh học nào khác của nuclein. Việc này phải nhờ đến Phoebus Levene. Đầu thập niên 1900, Levene cho biết nuclein mà Miescher đề cập chính là hỗn hợp giữa proteins và nucleic acids (cụ thể là ADN). NOTE: Có 2 loại nucleic acids: DNA và RNA.
Một số thông tin về proteins:
Ví dụ: chỉ với chuỗi gồm 4 amino acids thuộc từ 20 loại amino acids đó, ta có thể tạo ra 20^4 = 160000 sự kết hợp. Do đó, có thể nói rằng proteins có đủ mọi kích cỡ và hình dáng khác nhau. Một số thông tin về DNA (do Leuvene nghiên cứu):Nếu với proteins được tạo thành tử 20 đơn vị khác nhau thì phân tử DNA chỉ có 4 đơn vị tạo thành, gọi là nucleotides. Mỗi phân tử nucleotide được tạo thành từ 3 thành phần:bazơ có nhóm phosphate (mono-phosphate, pyrophosphate hoặc tri-phosphate), đường deoxyribose (đối với DNA) hoặc đường ribose (đối với RNA), và bazơ có chứa nitrogen (nitrogenous base). Vì trong nitrogenous base cũng có nguyên tố Carbon và được đánh số 1,2… nên nguyên tố Carbon trong phân tử đường được đánh số từ 1-5 kèm theo kí hiệu primer (‘). Theo hình vẽ, nitrogenous base luôn gắn vào C-1’, (với RNA, C-2′ sẽ gắn với -OH, thay vì proton -H như trong DNA), nhóm hydroxil -OH (hydroxil group) thì gắn vào C-3′ (nơi sẽ diễn ra liên kết phosphodiester với nucleotide khác để tạo ra chuỗi polymer), và gốc phosphate thì gắn vào C-5′. Như vậy, sự khác nhau giữa 4 nucleotides là ở nitrogenous base, được phân làm 2 loại: purine (Guanine, Adenine) và pyrimidine (Cystosine, Thymine). Để tạo thành DNA, Leuvene phát hiện rằng các phân tử nucleotides liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester (phosphodiester bond): 1 nhóm phosphate liên kết với hai phân tử đường: sugar thứ nhất là cùng nằm trên một phân tử nucleotide chứa bản thân gốc phosphate đó (gốc phosphate liên kết với C5′ của sugar) và sugar thứ hai thuộc một nucleotide khác (gốc phosphate liên kết với C3′ của sugar). Và ta lấy C5′ của sugar thuộc nucleotide có chứa gốc phosphate làm đầu (head) – tức là nơi sẽ không tiếp tục nhận thêm residue, còn C3′ của sugar còn lại làm đuôi (tail) – nơi có thể nối thêm residue. Như vậy, hướng liên kết trên chuỗi DNA là từ C5′ tới C3′ hay 5′ (5 prime) đến 3′ (3 prime). DNA vs. Protein:Ở các phần trước, ta đã biết nguyên liệu di truyền chứa trong nhân và cụ thể là nuclein (chromosomes). Câu hỏi đặt ra là: nguyên liệu di truyền là proteins hay DNA? Tại thời điểm này, mọi quan điểm đều cho rằng protein mang nguyên liệu di truyền. Lí do là vì khi so sánh protein và DNA, họ thấy rằng protein phức tạp hơn và các nhà khoa học cho rằng muốn lưu giữ nguyên liệu di truyền thì phải là rất phức tạp (Quan điểm này thực ra không đúng – sẽ được đề cập rõ ở các phần sau vì thực ra DNA mới mang nguyên liệu di truyền và protein là sản phẩm của nguyên liệu di truyền, đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện mọi chức năng của tế bào). Levene nghiên cứu thành phần hóa học của DNA và thấy DNA được tạo thành từ 4 đơn vị, ít hơn nhiều so với số đơn vị của proteins, Leuvene đã đưa ra một lí thuyết gọi là “tetranucleotide theory” (sau này đã được chứng thực là không đúng). Ông cho rằng, số lượng của từng loại nucleotides trong một phân tử DNA là như nhau. Theo đó, ông quan điểm là mỗi phân tử DNA được tạo thành bởi các khối, mỗi khối chứa 4 nucleotides, gọi là “tetranucleotide block“. Trong mỗi khối, các nucleotide được sắp xếp với trật tự cố định như nhau, và mỗi nucleodie chỉ xuất hiện 1 lần. Như vậy trong phân tử ADN, theo lý thuyết này, ta luôn có A=T=G=C. Quan điểm này đã được chấp nhận rộng rãi trong thập kỉ 1920 và 1930. Di truyền cơ bản 3 – gene & chromosome & cellDù quan điểm mỗi tính trạng (trait) được đại diện bởi một gene, gồm 2 thành phần (mỗi thành phần là một allele) và thường kí hiệu bằng một cặp chữ cái (hoa hoặc thường – chữ cái hoa biễu diễn đặc tính trội, chữ cái thường biễu diễn đặc tính lặn), nhưng gene là cái gì bên trong cơ thể, thành phần của nó ra sao, nó nằm ở đâu trong cơ thể thì vẫn còn là một bí ẩn. Nhờ vào sự phát minh ra kính hiển vi, người ta đã có thể nhìn thấy các vật rất nhỏ, cụ thể là nhìn thấy tế bào (cell). Vì thế, cho đến thời điểm đó, người ta vẫn tin rằng tế bào (cell) là đơn vị cơ bản của sự sống. Robert Hooke là người đầu tiên nhìn vào nút bịt chai rượu (cork) dưới kính hiển vi, năm 1665. Ông thấy có rất nhiều lỗ trống nhỏ và Hooke gọi chúng là “cell” (lỗ trống hay tế bào). Cooke thấy rằng cell tồn tại cả trong cây cối. Và với cây còn sống, thì cell chứa đầy các chất dịch (juices – mà sau này ta biết đến với cái tên là cytosol), còn với cây đã chết (như miếng gỗ làm cork) thì bên trong cell chỉ là không khí (Điều này lí giải vì sao cork và các cây gỗ khô có thể nổi trên mặt nước.) Tiếp theo sự phát hiện của Hooke, các nhà nghiên cứu khác cũng thực hiện việc khám phá qua kính hiển vi. Trong đó, có Theodor Schwann, ông định nghĩa “cell” không dựa vào hình dáng, kích cỡ, mà dựa vào sự xuất hiện của một khối được nhuộm đen bên trong – gọi là nhân (nucleus). NOTE: human cell có kích cỡ dao động từ 7micrometer (μm) đường kính (ví dụ: tế bào hồng cầu) đến 1m chiều dài (ví dụ: tế bào thần kinh). Để có thể hình dung, ta nhớ rằng chiều rộng của sợi tóc là khoảng 100μm. Nhờ vào công nghệ nhuộm màu phân tử, các cấu trúc bên trong của tế bào đã có thể được nhìn thấy. Ban đầu đó là nhân tế bào (nucleus) và sau này với những kĩ thuật nhuộm màu khác, người ta đã nhìn thấy các thành phần khác của tế bào. Sau đây là một số hình vẽ nhân (nucleus) bên trong tế bào: Về sau, khi mà dùng các chất nhuộm màu khác, thì người ta phát hiện ra những thành phần khác, nằm bên trong nhân (đối với tế bào có nhân). Cụ thể là các sợi dáng uốn cong, riêng biệt (hay thành phần hình que bên trong tế bào) và vì chúng có thể nhuộm màu được nên được gọi là nhiễm sắc thể (chromosomes). Và rồi, người ta nhận thấy rằng, tế bào của các chủng loài khác nhau thì có số lượng chromosomes khác nhau. Các nhà khoa học bắt đầu nghĩ tới khả năng chromosome mang các đơn vị thông tin di truyền (gene). Như vậy, tới đây ta hiểu rằng gene nằm bên trong chromosomes, và chromosome nằm bên trong nhân tế bào (cellular nucleus). TERMS:
“cô đặc” lại trong quá trình phân bào mitosis DNA cho người bắt đầuĐây là một link khá hay với nhiều giới thiệu đầy đủ và cơ sở kiến thức về gene, DNA: http://www.dnaftb.org/dnaftb/ |
